パーキンソン病の唾液と細胞外小胞 (RaSPiD)

パーキンソン病 (PD) は、運動緩慢、振戦、硬直、姿勢の不安定性などの運動症状を特徴とする神経変性疾患です。 患者の特定の特性を考慮して設計された正確なリハビリテーション プログラムにより、薬物療法の効果を最大化し、患者の生活の質を改善すると同時に、疾患の進行に関連する二次合併症を制限することができます。 しかし、診断時には、特発性パーキンソン病患者を迅速に特定し、進行性核上性麻痺 (PSP)、多系統萎縮症 (MSA) などの非定型パーキンソン病患者と区別できることが特に重要です。 、皮質基底核変性症（CBD）およびレビー小体型認知症（DLB）。 非定型パーキンソニズムは、実際には PD といくつかの徴候や症状を共有する進行性疾患ですが、これらの患者は、それらを特徴付ける細胞および変性メカニズムが非常に異なるため、薬物療法に効果的に反応しません。 これらの理由から、各患者にとって最良の薬理学的およびリハビリテーションの道筋を特定するために、早期の特定が特に重要です。

個々の複雑な臨床像を考慮したより正確な患者プロファイリングを確実にするために、簡単にアクセスできる生体液で定期的に測定できるバイオマーカーの発見は、より良い患者の層別化、疾患の経過のモニタリング、および慎重な研究を可能にします。患者に基づいて設計、定義、および構築された精密医療の観点から、薬理学的およびリハビリテーションプログラムの効果とその個別化。

Fondazione Don Gnocchi の Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) の研究室は、ラマン分光法などの革新的な方法を使用して、血液や唾液などの簡単にアクセスできる体液中の神経変性疾患のバイオマーカーを特定することに何年も取り組んできました。 ラマン分光法 (RS) を使用すると、分析対象のサンプルを前処理するための特別な手順を実行しなくても、迅速かつ高感度で非破壊的な方法で、特定の流体の特異的かつ完全な特性を得ることができます。 RS では、サンプルから得られたスペクトル全体が、診断バイオマーカーを表す選択されたサンプル (唾液、血液、血清、脳脊髄液など) の高度に特異的な「フィンガープリント」として使用されます。 唾液のラマン分析は、進行性病状の患者を正確にプロファイリングする可能性、特に、筋萎縮性側索硬化症に苦しむ対象を他のタイプの神経変性疾患の対象と比較して区別する可能性をすでに実証しています。

同時に、LABION は、PD 患者の血液中を循環する細胞外小胞 (EV) をラマン分光法で特徴付ける可能性を検証しました。 2017年以来、LABIONはPD患者の血清中の循環EVの生化学的研究に取り組んでおり、分光法でEVを分析し、臨床スケールと相関する血小胞の特定の生化学的プロファイルを識別するRSの能力が実証されています。 UPDRS III および Hoehn and Yahr。 PD患者の唾液に存在するEVの分析は、唾液の生化学的変化の起源を理解し、さらに特異的なマーカーを特定するのに役立ちます.

したがって、ラマン分光法は、染色や標識手順を使用せずに、唾液とその中に存在する小胞成分の迅速かつ包括的な生化学的特性評価のための有用な方法として提案されています。

このプロジェクトの目的は、さまざまな実験グループの特定のラマン分子シグネチャを検証することです。これは、非定型パーキンソニズムの被験者と比較した PD 患者の鑑別診断に役立つバイオマーカーの決定につながる可能性があります。したがって、迅速な鑑別診断および疾患の進展を監視するための測定可能なバイオマーカーの現在の不足を補います。

パーキンソン病および非定型パーキンソニズムの被験者の迅速な識別と鑑別診断により、各被験者に最適な薬理学的およびリハビリテーション療法を迅速に識別できるようになり、患者の生活の質が大幅に改善され、将来的には病気の進行を遅らせる確率。

サンプル収集: 選択されたすべての被験者からの唾液収集は、Salivette (SARSTEDT) 製造元の指示に従って実行されます。 唾液は、摂食および歯磨きから適切なラグタイムの後に、すべての被験者から得られます。 分析前のパラメータ（つまり 保存温度と収集と処理の間の時間)、食事と喫煙習慣が適切に記録されます。 簡単に言えば、スワブを口に入れ、60秒間噛んで唾液分泌を刺激します. 次に、スワブを 1,000 g で 2 分間遠心分離して、細胞の断片と食物の破片を取り除きます。 採取したサンプルは-80℃で保存します。

サンプル処理: ラマン分析では、表面増強ラマン散乱 (SERS) を実現するために、各サンプルのドロップをアルミ ホイルにキャストします。

EV 分離: 効果的な EV 分離のために、さまざまな分離方法がテストされます。 精製されたEVは、標準的な技術と、血液EV用に以前に最適化されたプロトコルに従ってラマン分光法によって濃縮および分析されます。 experimetal の設定は、基板、取得時間などの変動を考慮して、唾液 EV に適応されます。

データ収集: 唾液および EV スペクトルは、785 nm および 532 nm で動作するレーザー光源を備えたアラミス ラマン顕微鏡 (Horiba Jobin-Yvon、フランス) を使用して取得されます。 装置は、520.7 cm-1 のシリコンの参照バンドを使用して、各分析の前に校正されます。 ラマン スペクトルは、50 倍の対物レンズを使用して、唾液の場合は 400 ～ 1600 cm-1、EV の場合は 500 ～ 1800 cm-1、2600 ～ 3200 cm-1 の領域で取得されます。 スペクトルの取得には、ソフトウェア パッケージ LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon、フランス) を使用します。

データ処理: 取得されたすべてのスペクトルは、専用ソフトウェア LabSpec 6 を使用してベースライン補正され、単位ベクトルによって正規化されます。 基板の寄与は、必要に応じて各スペクトルから削除されます。 メソッドを検証するための統計分析は、多変量解析アプローチを使用して実行されます。 主成分分析 (PCA) は、データの次元を削減し、主要な傾向を証明するために実行されます。 結果として得られる最初の 20 個の主成分 (PC) は、分類モデルである線形判別分析 (LDA) で使用され、選択したグループ間の分散を最大化するデータを識別します。 データの過剰適合を防ぐために、最小数の PC が選択されます。 Leave-one-out 交差検証と混同行列テストを使用して、LDA モデルの方法の感度、精度、精度を評価します。 マンホイットニーは、分析されたグループ間で統計的に関連する違いを検証するために、PC スコアに対して実行されます。 0.05 未満の p 値を持つ係数のみを有効な相関と見なして、Spearman の検定を使用して相関および偏相関分析を実行します。 統計分析は、Origin2018 (OriginLab、米国) を使用して実行されます。

ROC 曲線を計算して、この方法の診断の可能性を評価します。