Salive et vésicules extracellulaires pour la maladie de Parkinson (RaSPiD)

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par des symptômes moteurs tels que la bradykinésie, les tremblements, la rigidité et l'instabilité posturale. Un programme de rééducation précis conçu en tenant compte des caractéristiques spécifiques du patient permet de maximiser l'effet de la pharmacothérapie, d'améliorer la qualité de vie du patient, tout en limitant les complications secondaires liées à la progression de la maladie. Au moment du diagnostic, cependant, il est particulièrement important de pouvoir identifier rapidement les personnes atteintes de la maladie de Parkinson idiopathique et de les distinguer de celles qui ont une forme atypique de parkinsonisme, comme la paralysie supranucléaire progressive (PSP), l'atrophie multisystématisée (MSA) , la dégénérescence corticobasale (CBD) et la démence à corps de Lewy (DLB). Les parkinsonismes atypiques sont en fait des maladies évolutives qui partagent certains signes et symptômes avec la MP, cependant ces patients ne répondent pas aussi efficacement au traitement médicamenteux car les mécanismes cellulaires et dégénératifs qui les caractérisent sont très différents. Pour ces raisons, leur identification précoce est particulièrement importante pour identifier la meilleure voie pharmacologique et rééducative pour chaque patient.

Afin d'assurer un profilage plus précis des patients qui tienne compte du tableau clinique complexe individuel, la découverte d'un biomarqueur pouvant être mesuré périodiquement dans un biofluide facilement accessible permettrait une meilleure stratification des patients, un suivi de l'évolution de la maladie et une étude approfondie de les effets du programme pharmacologique et rééducatif ainsi que sa personnalisation, dans la perspective d'une médecine de précision conçue, définie et construite sur le patient.

Le Laboratoire de nanomédecine et de biophotonique clinique (LABION) de la Fondazione Don Gnocchi travaille depuis des années sur l'utilisation de méthodes innovantes telles que la spectroscopie Raman pour identifier des biomarqueurs de maladies neurodégénératives dans des fluides biologiques facilement accessibles, tels que le sang et la salive. La spectroscopie Raman (RS) permet d'obtenir une caractérisation spécifique et complète d'un fluide spécifique de manière rapide, sensible et non destructive, sans procédures particulières pour la préparation de l'échantillon à analyser. Dans RS, le spectre entier obtenu à partir de l'échantillon est utilisé comme une "empreinte digitale" hautement spécifique pour l'échantillon sélectionné (par exemple, salive, sang, sérum, liquide céphalo-rachidien) qui représente le biomarqueur diagnostique. L'analyse Raman de la salive a déjà démontré la possibilité de profiler avec une bonne précision les patients atteints de pathologies évolutives et, notamment, de distinguer les sujets atteints de sclérose latérale amyotrophique des sujets atteints d'autres types de maladies neurodégénératives.

Parallèlement, LABION a vérifié la possibilité de caractériser par spectroscopie Raman, les vésicules extracellulaires (VE) circulant dans le sang de patients atteints de MP. Depuis 2017, LABION travaille sur l'étude biochimique des VE circulants dans le sérum des patients parkinsoniens en analysant les VE en spectroscopie et la capacité de RS à identifier un profil biochimique spécifique des vésicules sanguines en corrélation avec les échelles cliniques a été démontrée. UPDRS III et Hoehn et Yahr. L'analyse des VE présents dans la salive des patients atteints de MP pourrait aider à comprendre l'origine des altérations biochimiques de la salive ainsi qu'à identifier des marqueurs encore plus spécifiques.

La spectroscopie Raman est donc proposée comme une méthode utile pour la caractérisation biochimique rapide et complète de la salive et du composant vésiculaire présent en son sein, sans l'utilisation de procédures de coloration et d'étiquetage.

L'objectif de ce projet est la validation d'une signature moléculaire Raman spécifique pour les différents groupes expérimentaux, pouvant conduire à la détermination d'un biomarqueur utile au diagnostic différentiel des personnes atteintes de la MP par rapport aux sujets parkinsoniens atypiques, par l'analyse d'un liquide biologique non invasif, comblant ainsi le manque actuel d'un biomarqueur mesurable pour un diagnostic différentiel rapide et pour le suivi de l'évolution des maladies.

L'identification rapide et le diagnostic différentiel des sujets atteints de la maladie de Parkinson et de parkinsonismes atypiques permettront d'identifier rapidement la thérapie pharmacologique et de réadaptation optimale pour chaque sujet, entraînant une amélioration significative de la qualité de vie du patient et, à l'avenir, une augmentation probabilité de ralentir la progression de la maladie.

COLLECTE D'ÉCHANTILLONS : La collecte de la salive de tous les sujets sélectionnés sera effectuée conformément aux instructions du fabricant de la salivette (SARSTEDT). La salive sera obtenue de tous les sujets après un temps de latence approprié après l'alimentation et le brossage des dents. Paramètres pré-analytiques (c.-à-d. la température de stockage et le temps entre la collecte et le traitement), les habitudes alimentaires et de tabagisme seront correctement enregistrées. En bref, l'écouvillon sera placé dans la bouche et mâché pendant 60 secondes pour stimuler la salivation. Ensuite, l'écouvillon sera centrifugé pendant 2 minutes à 1 000 g pour éliminer les fragments de cellules et les débris alimentaires. Les échantillons collectés seront conservés à -80°C.

TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS : Pour l'analyse Raman, une goutte de chaque échantillon sera coulée sur une feuille d'aluminium afin d'obtenir la diffusion Raman améliorée en surface (SERS).

ISOLATION EV : différentes méthodes d'isolation seront testées pour une isolation EV efficace. Les VE purifiés seront ensuite concentrés et analysés au moyen de techniques standards et par spectroscopie Raman selon un protocole préalablement optimisé pour les VE sanguins. Les paramètres expérimentaux seront adaptés aux VE salivaires, en tenant compte des variations de substrat, du temps d'acquisition, etc.

COLLECTE DES DONNÉES : Les spectres salivaires et EV seront acquis à l'aide d'un microscope Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, France) équipé d'une source de lumière laser fonctionnant à 785 nm et 532 nm. L'instrument sera calibré avant chaque analyse en utilisant la bande de référence du silicium à 520,7 cm-1. Les spectres Raman seront acquis dans la région entre 400 et 1600 cm-1 pour la salive, 500-1800 et 2600-3200 cm-1 pour les VE en utilisant un objectif 50x. Le progiciel LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, France) sera utilisé pour l'acquisition des spectres.

TRAITEMENT DES DONNEES : Tous les spectres acquis seront corrigés de la ligne de base et normalisés par vecteur unitaire à l'aide du logiciel dédié LabSpec 6. La contribution du substrat sera retirée de chaque spectre, si nécessaire. L'analyse statistique pour valider la méthode sera effectuée en utilisant une approche d'analyse multivariée. Une analyse en composantes principales (ACP) sera effectuée afin de réduire les dimensions des données et de mettre en évidence les principales tendances. Les 20 premières composantes principales (PC) résultantes seront utilisées dans un modèle de classification, l'analyse discriminante linéaire (ADL), pour discriminer les données en maximisant la variance entre les groupes sélectionnés. Le plus petit nombre de PC sera sélectionné pour éviter le surajustement des données. La validation croisée et le test de matrice de confusion seront utilisés pour évaluer la sensibilité, la précision et l'exactitude de la méthode du modèle LDA. Mann-Whitney sera effectué sur les scores PC pour vérifier les différences statistiquement pertinentes entre les groupes analysés. L'analyse de corrélation et de corrélation partielle sera effectuée à l'aide du test de Spearman, en supposant comme corrélation valide uniquement les coefficients avec une valeur p inférieure à 0,05. L'analyse statistique sera effectuée à l'aide d'Origin2018 (OriginLab, États-Unis).

La courbe ROC sera calculée pour évaluer le potentiel diagnostique de la méthode.