Speichel und extrazelluläre Vesikel für die Parkinson-Krankheit (RaSPiD)

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch motorische Symptome wie Bradykinesie, Tremor, Steifheit und posturale Instabilität gekennzeichnet ist. Ein genaues Rehabilitationsprogramm, das unter Berücksichtigung der spezifischen Merkmale des Patienten entwickelt wurde, ermöglicht es Ihnen, die Wirkung der medikamentösen Therapie zu maximieren, die Lebensqualität des Patienten zu verbessern und gleichzeitig sekundäre Komplikationen im Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Krankheit zu begrenzen. Zum Zeitpunkt der Diagnose ist es jedoch besonders wichtig, Personen mit idiopathischem Parkinson schnell identifizieren und von denen unterscheiden zu können, die an einer atypischen Form des Parkinsonismus leiden, wie z. , kortikobasale Degeneration (CBD) und Demenz mit Lewy-Körperchen (DLB). Atypische Parkinsonismen sind tatsächlich fortschreitende Krankheiten, die einige Anzeichen und Symptome mit PD teilen, jedoch sprechen diese Patienten nicht so effektiv auf eine medikamentöse Therapie an, da die zellulären und degenerativen Mechanismen, die sie charakterisieren, sehr unterschiedlich sind. Aus diesen Gründen ist ihre frühzeitige Identifizierung besonders wichtig, um den besten pharmakologischen und rehabilitativen Weg für jeden Patienten zu finden.

Um eine genauere Patientenprofilierung zu gewährleisten, die das individuelle komplexe Krankheitsbild berücksichtigt, würde die Entdeckung eines Biomarkers, der regelmäßig in einer leicht zugänglichen Bioflüssigkeit gemessen werden kann, eine bessere Patientenstratifizierung, Überwachung des Krankheitsverlaufs und sorgfältige Untersuchung ermöglichen die Auswirkungen des pharmakologischen und Rehabilitationsprogramms sowie seine Personalisierung im Hinblick auf eine auf den Patienten ausgerichtete, definierte und aufgebaute Präzisionsmedizin.

Das Labor für Nanomedizin und klinische Biophotonik (LABION) der Fondazione Don Gnocchi arbeitet seit Jahren daran, mithilfe innovativer Methoden wie der Raman-Spektroskopie Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen in leicht zugänglichen biologischen Flüssigkeiten wie Blut und Speichel zu identifizieren. Die Raman-Spektroskopie (RS) ermöglicht eine schnelle, empfindliche und zerstörungsfreie spezifische und vollständige Charakterisierung einer bestimmten Flüssigkeit, ohne besondere Verfahren zur Vorbereitung der zu analysierenden Probe. Bei RS wird das gesamte aus der Probe gewonnene Spektrum als hochspezifischer „Fingerabdruck“ für die ausgewählte Probe (z. B. Speichel, Blut, Serum, Liquor) verwendet, die den diagnostischen Biomarker darstellt. Die Raman-Analyse von Speichel hat bereits die Möglichkeit gezeigt, Patienten mit fortschreitenden Pathologien mit guter Genauigkeit zu profilieren und insbesondere Patienten, die an amyotropher Lateralsklerose leiden, von Patienten mit anderen Arten von neurodegenerativen Erkrankungen zu unterscheiden.

Gleichzeitig hat LABION die Möglichkeit verifiziert, die im Blut von Patienten mit Parkinson zirkulierenden extrazellulären Vesikel (EV) durch Raman-Spektroskopie zu charakterisieren. Seit 2017 arbeitet LABION an der biochemischen Untersuchung zirkulierender Elektrofahrzeuge im Serum von Parkinson-Patienten, indem die Elektrofahrzeuge in der Spektroskopie analysiert und die Fähigkeit von RS zur Identifizierung eines spezifischen biochemischen Profils von Blutbläschen, das mit klinischen Skalen korreliert, nachgewiesen wurde. UPDRS III und Hoehn und Yahr. Die Analyse der im Speichel von Patienten mit Parkinson vorhandenen EVs könnte helfen, den Ursprung biochemischer Veränderungen im Speichel zu verstehen und noch spezifischere Marker zu identifizieren.

Die Raman-Spektroskopie wird daher als nützliche Methode zur schnellen und umfassenden biochemischen Charakterisierung von Speichel und der darin vorhandenen vesikulären Komponente ohne die Verwendung von Färbe- und Markierungsverfahren vorgeschlagen.

Das Ziel dieses Projekts ist die Validierung einer spezifischen molekularen Raman-Signatur für die verschiedenen experimentellen Gruppen, die zur Bestimmung eines Biomarkers führen kann, der für die Differentialdiagnose von Menschen mit Parkinson im Vergleich zu Patienten mit atypischem Parkinsonismus nützlich ist, durch die Analyse von a biologische Flüssigkeit, die nicht invasiv ist, wodurch der derzeitige Mangel an messbaren Biomarkern für eine schnelle Differentialdiagnose und zur Überwachung der Entwicklung der Krankheiten behoben wird.

Die schnelle Identifizierung und Differentialdiagnose von Personen mit Parkinson-Krankheit und atypischem Parkinsonismus wird es ermöglichen, die optimale pharmakologische und rehabilitative Therapie für jede Person umgehend zu identifizieren, was zu einer signifikanten Verbesserung der Lebensqualität des Patienten und in Zukunft zu einer Steigerung führt Wahrscheinlichkeit, das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen.

PROBENENTNAHME: Die Speichelsammlung von allen ausgewählten Probanden wird gemäß den Anweisungen des Herstellers der Salivette (SARSTEDT) durchgeführt. Speichel wird von allen Probanden nach einer angemessenen Verzögerungszeit von der Nahrungsaufnahme und dem Zähneputzen erhalten. Präanalytische Parameter (d.h. Lagertemperatur und Zeit zwischen Entnahme und Verarbeitung), Ernährungs- und Rauchgewohnheiten werden ordnungsgemäß aufgezeichnet. Der Tupfer wird kurz in den Mund genommen und 60 Sekunden lang gekaut, um den Speichelfluss anzuregen. Anschließend wird der Tupfer für 2 Minuten bei 1.000 g zentrifugiert, um Zellfragmente und Speisereste zu entfernen. Gesammelte Proben werden bei -80 °C gelagert.

PROBENVERARBEITUNG: Für die Raman-Analyse wird ein Tropfen jeder Probe auf eine Aluminiumfolie gegossen, um die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) zu erreichen.

EV-ISOLIERUNG: Verschiedene Isolierungsmethoden werden auf effektive EV-Isolierung getestet. Gereinigte EVs werden dann konzentriert und mit Standardtechniken und durch Raman-Spektroskopie nach einem zuvor optimierten Protokoll für Blut-EVs analysiert. Die experimentellen Einstellungen werden an die Speichel-EVs angepasst, wobei Variationen in Substrat, Aufnahmezeit usw. berücksichtigt werden.

DATENSAMMLUNG: Speichel- und EV-Spektren werden unter Verwendung eines Aramis-Raman-Mikroskops (Horiba Jobin-Yvon, Frankreich) erfasst, das mit einer Laserlichtquelle ausgestattet ist, die bei 785 nm und 532 nm arbeitet. Das Instrument wird vor jeder Analyse unter Verwendung der Referenzbande von Silizium bei 520,7 cm-1 kalibriert. Raman-Spektren werden im Bereich zwischen 400 und 1600 cm-1 für Speichel, 500-1800 und 2600-3200 cm-1 für EVs mit einem 50x-Objektiv erfasst. Für die Aufnahme von Spektren wird das Softwarepaket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankreich) verwendet.

DATENVERARBEITUNG: Alle erfassten Spektren werden mit der dedizierten Software LabSpec 6 grundlinienkorrigiert und durch den Einheitsvektor normalisiert. Der Beitrag des Substrats wird bei Bedarf aus jedem Spektrum entfernt. Die statistische Analyse zur Validierung der Methode wird mit einem multivariaten Analyseansatz durchgeführt. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird durchgeführt, um die Datendimensionen zu reduzieren und wichtige Trends aufzuzeigen. Die ersten 20 resultierenden Hauptkomponenten (PCs) werden in einem Klassifikationsmodell, der linearen Diskriminanzanalyse (LDA), verwendet, um die Daten zu diskriminieren und die Varianz zwischen den ausgewählten Gruppen zu maximieren. Es wird die kleinste Anzahl von PCs ausgewählt, um eine Datenüberanpassung zu verhindern. Leave-One-Out-Kreuzvalidierung und Konfusionsmatrix-Test werden verwendet, um die Empfindlichkeit, Präzision und Genauigkeit der Methode des LDA-Modells zu bewerten. Mann-Whitney wird an PC-Scores durchgeführt, um die statistisch relevanten Unterschiede zwischen den analysierten Gruppen zu überprüfen. Die Korrelations- und Teilkorrelationsanalyse wird unter Verwendung des Spearman-Tests durchgeführt, wobei nur die Koeffizienten mit einem p-Wert kleiner als 0,05 als gültige Korrelation angenommen werden. Die statistische Auswertung erfolgt mit Origin2018 (OriginLab, USA).

Die ROC-Kurve wird berechnet, um das diagnostische Potenzial der Methode zu beurteilen.