Слюна и внеклеточные везикулы при болезни Паркинсона (RaSPiD)

Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой нейродегенеративное заболевание, характеризующееся двигательными симптомами, такими как брадикинезия, тремор, ригидность и постуральная неустойчивость. Точная программа реабилитации, разработанная с учетом особенностей пациента, позволяет максимально увеличить эффект медикаментозной терапии, улучшить качество жизни пациента, а также ограничить вторичные осложнения, связанные с прогрессированием заболевания. Однако во время постановки диагноза особенно важно иметь возможность быстро идентифицировать людей с идиопатическим паркинсонизмом и отличить их от тех, у кого есть атипичная форма паркинсонизма, такая как прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), множественная системная атрофия (МСА). , кортикобазальная дегенерация (CBD) и деменция с тельцами Леви (DLB). Атипичные паркинсонизмы на самом деле являются прогрессирующими заболеваниями, которые имеют некоторые общие признаки и симптомы с болезнью Паркинсона, однако эти пациенты не так эффективно реагируют на лекарственную терапию, поскольку характерные для них клеточные и дегенеративные механизмы сильно различаются. По этим причинам их раннее выявление особенно важно для определения наилучшего фармакологического и реабилитационного пути для каждого пациента.

Для обеспечения более точного профилирования пациентов, учитывающего индивидуальную сложную клиническую картину, открытие биомаркера, который можно периодически измерять в легкодоступной биожидкости, позволило бы улучшить стратификацию пациентов, мониторинг течения заболевания и тщательное изучение эффекты фармакологической и реабилитационной программы, а также ее персонализация с целью точной медицины, разработанной, определенной и построенной на пациенте.

Лаборатория наномедицины и клинической биофотоники (LABION) Fondazione Don Gnocchi уже много лет работает над использованием инновационных методов, таких как рамановская спектроскопия, для выявления биомаркеров нейродегенеративных заболеваний в легкодоступных биологических жидкостях, таких как кровь и слюна. Рамановская спектроскопия (РС) позволяет получить точную и полную характеристику конкретной жидкости быстрым, чувствительным и неразрушающим способом без особых процедур подготовки анализируемого образца. В РС весь спектр, полученный из образца, используется как высокоспецифичный «отпечаток пальца» для выбранного образца (например, слюны, крови, сыворотки, спинномозговой жидкости), который представляет собой диагностический биомаркер. Рамановский анализ слюны уже продемонстрировал возможность с хорошей точностью профилировать пациентов с прогрессирующей патологией и, в частности, отличать лиц, страдающих боковым амиотрофическим склерозом, от лиц с другими типами нейродегенеративных заболеваний.

В то же время LABION подтвердил возможность характеризации с помощью рамановской спектроскопии внеклеточных везикул (ВВ), циркулирующих в крови пациентов с БП. С 2017 года в ЛАБИОН ведутся работы по биохимическому изучению циркулирующих ВВ в сыворотке крови больных БП путем анализа ВВ в спектроскопии, и была продемонстрирована способность РС идентифицировать специфический биохимический профиль кровяных везикул, коррелирующий с клиническими шкалами. UPDRS III и Хен и Яр. Анализ ВВ, присутствующих в слюне пациентов с БП, может помочь понять происхождение биохимических изменений в слюне, а также выявить еще более специфические маркеры.

Таким образом, рамановская спектроскопия предлагается в качестве полезного метода для быстрой и всесторонней биохимической характеристики слюны и присутствующего в ней везикулярного компонента без использования процедур окрашивания и маркировки.

Целью этого проекта является проверка специфического рамановского молекулярного сигнатуры для различных экспериментальных групп, что может привести к определению биомаркера, полезного для дифференциальной диагностики людей с БП по сравнению с субъектами с атипичным паркинсонизмом, посредством анализа биологическая жидкость, которая не является инвазивной, тем самым восполняя нынешнюю нехватку измеримого биомаркера для быстрой дифференциальной диагностики и мониторинга развития заболеваний.

Быстрое выявление и дифференциальная диагностика пациентов с болезнью Паркинсона и атипичными паркинсонизмами позволит оперативно подобрать оптимальную фармакологическую и реабилитационную терапию для каждого субъекта, что приведет к значительному улучшению качества жизни пациента и, в дальнейшем, увеличению вероятность замедления прогрессирования заболевания.

СБОР ОБРАЗЦОВ: Сбор слюны у всех выбранных субъектов будет проводиться в соответствии с инструкциями производителя Salivette (SARSTEDT). Слюна будет получена от всех испытуемых после соответствующего времени ожидания от кормления и чистки зубов. Преданалитические параметры (т.е. температура хранения и время между сбором и обработкой), диета и привычка курения будут надлежащим образом зарегистрированы. Вкратце, тампон помещают в рот и разжевывают в течение 60 секунд, чтобы стимулировать слюноотделение. Затем мазок центрифугируют в течение 2 минут при 1000 g для удаления фрагментов клеток и остатков пищи. Собранные образцы будут храниться при температуре -80°C.

ОБРАБОТКА ОБРАЗЦА: Для анализа комбинационного рассеяния капля каждого образца будет отлита на алюминиевую фольгу для достижения поверхностного усиленного комбинационного рассеяния (SERS).

ИЗОЛЯЦИЯ ЭВМ: различные методы изоляции будут испытаны для эффективной изоляции ЭВ. Затем очищенные ЭВ концентрируют и анализируют с помощью стандартных методов и спектроскопии комбинационного рассеяния в соответствии с ранее оптимизированным протоколом для ЭВ крови. Экспериментальные настройки будут адаптированы к слюнным EV с учетом различий в субстрате, времени сбора данных и т. д.

СБОР ДАННЫХ: Спектры слюны и EV будут получены с использованием рамановского микроскопа Aramis (Horiba Jobin-Yvon, Франция), оснащенного лазерным источником света, работающим на 785 нм и 532 нм. Прибор калибруется перед каждым анализом с использованием эталонной полосы кремния при 520,7 см-1. Спектры КР будут получены в диапазоне от 400 до 1600 см-1 для слюны, 500-1800 и 2600-3200 см-1 для ЭВ с использованием объектива с 50-кратным увеличением. Пакет программного обеспечения LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Франция) будет использоваться для получения спектров.

ОБРАБОТКА ДАННЫХ: Все полученные спектры будут скорректированы по базовой линии и нормализованы по единичному вектору с использованием специального программного обеспечения LabSpec 6. При необходимости вклад субстрата будет удален из каждого спектра. Статистический анализ для проверки метода будет выполняться с использованием подхода многомерного анализа. Анализ основных компонентов (PCA) будет выполняться для уменьшения размерности данных и выявления основных тенденций. Первые 20 результирующих основных компонентов (PC) будут использоваться в модели классификации, линейном дискриминантном анализе (LDA), чтобы различать данные, максимизируя дисперсию между выбранными группами. Будет выбрано наименьшее количество компьютеров, чтобы предотвратить переобучение данных. Для оценки чувствительности метода, прецизионности и точности модели LDA будут использоваться перекрестная проверка с исключением одного и тест матрицы путаницы. Манн-Уитни будет выполняться по баллам ПК, чтобы проверить статистически значимые различия между анализируемыми группами. Корреляционный и частичный корреляционный анализ будут выполняться с использованием критерия Спирмена, принимая за достоверную корреляцию только коэффициенты с p-значением ниже 0,05. Статистический анализ будет проводиться с помощью программы Origin2018 (OriginLab, США).

Кривая ROC будет рассчитана для оценки диагностического потенциала метода.