Speeksel en extracellulaire blaasjes voor de ziekte van Parkinson (RaSPiD)

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door motorische symptomen zoals bradykinesie, tremor, rigiditeit en posturale instabiliteit. Een nauwkeurig revalidatieprogramma dat is ontworpen met inachtneming van de specifieke kenmerken van de patiënt, stelt u in staat het effect van medicamenteuze therapie te maximaliseren, de kwaliteit van leven van de patiënt te verbeteren en tegelijkertijd secundaire complicaties die verband houden met de progressie van de ziekte te beperken. Op het moment van de diagnose is het echter bijzonder belangrijk om snel personen met idiopathische Parkinson te kunnen identificeren en hen te kunnen onderscheiden van degenen met een atypische vorm van Parkinsonisme, zoals Progressive Supranuclear Palsy (PSP), Multiple System Atrophy (MSA). , Corticobasale Degeneratie (CBD) en Dementie met Lewy-lichaampjes (DLB). Atypische parkinsonismen zijn in feite progressieve ziekten die enkele tekenen en symptomen gemeen hebben met de ziekte van Parkinson, maar deze patiënten reageren niet zo effectief op medicamenteuze therapie omdat de cellulaire en degeneratieve mechanismen die hen kenmerken heel verschillend zijn. Om deze redenen is hun vroege identificatie bijzonder belangrijk om het beste farmacologische en revalidatietraject voor elke patiënt te bepalen.

Om te zorgen voor een meer accurate patiëntprofilering die rekening houdt met het individuele complexe klinische beeld, zou de ontdekking van een biomarker die periodiek kan worden gemeten in een gemakkelijk toegankelijke biovloeistof een betere patiëntstratificatie, monitoring van het ziekteverloop en zorgvuldige studie van de ziekte mogelijk maken. de effecten van het farmacologische en revalidatieprogramma, evenals de personalisatie ervan, met het oog op precisiegeneeskunde die is ontworpen, gedefinieerd en gebouwd op de patiënt.

Het Laboratorium voor Nanogeneeskunde en Klinische Biofotonica (LABION) van Fondazione Don Gnocchi werkt al jaren aan het gebruik van innovatieve methoden zoals Raman-spectroscopie om biomarkers van neurodegeneratieve ziekten te identificeren in gemakkelijk toegankelijke biologische vloeistoffen, zoals bloed en speeksel. Raman Spectroscopie (RS) maakt het mogelijk om op een snelle, gevoelige en niet-destructieve manier een specifieke en volledige karakterisering van een specifieke vloeistof te verkrijgen, zonder specifieke procedures voor de voorbereiding van het te analyseren monster. Bij RS wordt het volledige spectrum verkregen uit het monster gebruikt als een zeer specifieke "vingerafdruk" voor het geselecteerde monster (bijv. speeksel, bloed, serum, cerebrospinale vloeistof) dat de diagnostische biomarker vertegenwoordigt. De Raman-analyse van speeksel heeft al de mogelijkheid aangetoond om patiënten met progressieve pathologieën met goede nauwkeurigheid te profileren en, met name, om patiënten die lijden aan amyotrofische laterale sclerose te onderscheiden van patiënten met andere soorten neurodegeneratieve ziekten.

Tegelijkertijd heeft LABION de mogelijkheid geverifieerd om door Raman-spectroscopie de extracellulaire blaasjes (EV) die circuleren in het bloed van patiënten met de ziekte van Parkinson te karakteriseren. Sinds 2017 werkt LABION aan de biochemische studie van circulerende EV's in het serum van PD-patiënten door de EV's in spectroscopie te analyseren en het vermogen van RS om een ​​specifiek biochemisch profiel van bloedblaasjes te identificeren dat correleert met klinische schalen is aangetoond. UPDRS III en Hoehn en Yahr. De analyse van de EV's die aanwezig zijn in het speeksel van patiënten met de ziekte van Parkinson zou kunnen helpen om de oorsprong van biochemische veranderingen in het speeksel te begrijpen en zelfs nog specifiekere markers te identificeren.

Raman-spectroscopie wordt daarom voorgesteld als een bruikbare methode voor de snelle en uitgebreide biochemische karakterisering van speeksel en de daarin aanwezige vesiculaire component, zonder het gebruik van kleur- en labelprocedures.

Het doel van dit project is de validatie van een specifieke Raman moleculaire signatuur voor de verschillende experimentele groepen, wat kan leiden tot de bepaling van een biomarker die nuttig is voor de differentiële diagnose van mensen met de ziekte van Parkinson in vergelijking met proefpersonen met atypisch parkinsonisme, door de analyse van een biologische vloeistof die niet invasief is, en zo het huidige gebrek aan een meetbare biomarker opvult voor snelle differentiële diagnose en voor het volgen van de evolutie van de ziekten.

De snelle identificatie en differentiële diagnose van patiënten met de ziekte van Parkinson en atypische parkinsonismen zal het mogelijk maken om snel de optimale farmacologische en revalidatietherapie voor elke patiënt te identificeren, wat zal leiden tot een aanzienlijke verbetering van de levenskwaliteit van de patiënt en, in de toekomst, een verhoogde waarschijnlijkheid die de progressie van de ziekte vertraagt.

MONSTERVERZAMELING: Speekselverzameling van alle geselecteerde proefpersonen zal worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van Salivette (SARSTEDT). Speeksel zal van alle proefpersonen worden verkregen na een passende vertraging van het voeden en tandenpoetsen. Pre-analytische parameters (d.w.z. bewaartemperatuur en tijd tussen verzameling en verwerking), voedings- en rookgewoonten worden correct geregistreerd. In het kort wordt het wattenstaafje in de mond geplaatst en gedurende 60 seconden gekauwd om de speekselafscheiding te stimuleren. Vervolgens wordt het wattenstaafje gedurende 2 minuten gecentrifugeerd bij 1.000 g om celfragmenten en voedselresten te verwijderen. Verzamelde monsters worden bewaard bij -80° C.

MONSTERVERWERKING: Voor de Raman-analyse wordt een druppel van elk monster op een aluminiumfolie gegoten om de Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) te bereiken.

EV-ISOLATIE: verschillende isolatiemethoden worden getest voor effectieve EV-isolatie. Gezuiverde EV's zullen vervolgens worden geconcentreerd en geanalyseerd door middel van standaardtechnieken en door Raman-spectroscopie volgens een eerder geoptimaliseerd protocol voor bloed-EV's. De experimentele instellingen zullen worden aangepast aan de speeksel-EV's, rekening houdend met variaties in substraat, acquisitietijd, enz.

GEGEVENSVERZAMELING: Speeksel- en EV-spectra zullen worden verkregen met behulp van een Aramis Raman-microscoop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrijk) uitgerust met een laserlichtbron die werkt bij 785 nm en 532 nm. Het instrument wordt vóór elke analyse gekalibreerd met behulp van de referentieband van silicium op 520,7 cm-1. Raman-spectra zullen worden verkregen in het gebied tussen 400 en 1600 cm-1 voor speeksel, 500-1800 en 2600-3200 cm-1 voor EV's met behulp van een 50x objectief. Voor de acquisitie van spectra zal het softwarepakket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrijk) worden gebruikt.

GEGEVENSVERWERKING: Alle verkregen spectra worden gecorrigeerd naar de basislijn en genormaliseerd per eenheidsvector met behulp van de speciale software LabSpec 6. De bijdrage van het substraat zal, indien nodig, uit elk spectra worden verwijderd. De statistische analyse om de methode te valideren, zal worden uitgevoerd met behulp van een multivariate analysebenadering. Er zal een Principal Component-analyse (PCA) worden uitgevoerd om de gegevensdimensies te verkleinen en belangrijke trends aan te tonen. De eerste 20 resulterende Principal Components (PC's) zullen worden gebruikt in een classificatiemodel, Linear Discriminant Analysis (LDA), om de gegevens te onderscheiden en de variantie tussen de geselecteerde groepen te maximaliseren. Het kleinste aantal pc's wordt geselecteerd om overfitting van gegevens te voorkomen. Leave-one-out kruisvalidatie en verwarringsmatrixtest zullen worden gebruikt om de methodegevoeligheid, precisie en nauwkeurigheid van het LDA-model te evalueren. Mann-Whitney zal worden uitgevoerd op pc-scores om de statistisch relevante verschillen tussen de geanalyseerde groepen te verifiëren. Correlatie- en partiële correlatieanalyse zullen worden uitgevoerd met behulp van de Spearman's test, waarbij alleen de coëfficiënten met een p-waarde lager dan 0,05 als geldige correlatie worden aangenomen. De statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van Origin2018 (OriginLab, VS).

De ROC-curve wordt berekend om het diagnostische potentieel van de methode te beoordelen.