파킨슨병의 침과 세포밖 소포체 (RaSPiD)

파킨슨병(PD)은 운동완서, 떨림, 경직 및 자세 불안정과 같은 운동 증상을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환입니다. 환자의 특수한 특성을 고려하여 설계된 정확한 재활 프로그램으로 약물 치료의 효과를 극대화하고 환자의 삶의 질을 향상시키며 질병의 진행과 관련된 2차 합병증을 제한할 수 있습니다. 그러나 진단 당시 특발성 파킨슨병 환자를 신속하게 식별하고 진행성 핵상 마비(PSP), 다계통 위축(MSA)과 같은 비정형 형태의 파킨슨병 환자와 구별할 수 있는 것이 특히 중요합니다. , Corticobasal Degeneration (CBD) 및 Lewy 소체를 가진 치매 (DLB). 비정형 파킨슨증은 사실 파킨슨병과 일부 징후 및 증상을 공유하는 진행성 질환이지만, 이들 환자를 특징짓는 세포 및 퇴행성 메커니즘이 매우 다르기 때문에 이러한 환자는 약물 요법에 효과적으로 반응하지 않습니다. 이러한 이유로 조기 식별은 각 환자에게 가장 적합한 약리학적 및 재활 경로를 식별하는 데 특히 중요합니다.

개별적인 복잡한 임상상을 고려한 보다 정확한 환자 프로파일링을 보장하기 위해 쉽게 접근할 수 있는 생체 유체에서 주기적으로 측정할 수 있는 바이오마커의 발견은 더 나은 환자 계층화, 질병 경과 모니터링 및 주의 깊은 연구를 가능하게 할 것입니다. 환자에 맞게 설계, 정의 및 구축된 정밀 의학의 관점에서 약리학 및 재활 프로그램의 효과와 개인화.

Fondazione Don Gnocchi의 Nanomedicine and Clinical Biophotonics 연구실(LABION)은 Raman 분광법과 같은 혁신적인 방법을 사용하여 혈액 및 타액과 같이 쉽게 접근할 수 있는 생물학적 유체에서 신경퇴행성 질환의 바이오마커를 식별하기 위해 수년 동안 노력해 왔습니다. Raman Spectroscopy(RS)를 사용하면 분석할 샘플 준비를 위한 특별한 절차 없이 신속하고 민감하며 비파괴적인 방식으로 특정 유체의 구체적이고 완전한 특성을 얻을 수 있습니다. RS에서 샘플에서 얻은 전체 스펙트럼은 진단 바이오마커를 나타내는 선택된 샘플(예: 타액, 혈액, 혈청, 뇌척수액)에 대해 매우 특정한 "지문"으로 사용됩니다. 타액의 라만 분석은 이미 진행성 병리학을 가진 환자를 좋은 정확도로 프로파일링하고 특히 다른 유형의 신경퇴행성 질환을 가진 피험자와 비교하여 근위축성 측삭 경화증을 앓고 있는 피험자를 구별할 수 있는 가능성을 입증했습니다.

동시에 LABION은 파킨슨병 환자의 혈액에서 순환하는 세포외소포(EV)를 라만 분광법으로 특성화할 수 있는 가능성을 검증했다. LABION은 2017년부터 분광학에서 EV를 분석하여 PD 환자의 혈청에서 순환하는 EV의 생화학적 연구를 진행하고 있으며 임상 척도와 상관관계가 있는 혈액 소포의 특정 생화학적 프로파일을 식별하는 RS의 능력이 입증되었습니다. UPDRS III 및 Hoehn 및 Yahr. PD 환자의 타액에 존재하는 EV의 분석은 타액의 생화학적 변화의 기원을 이해하고 훨씬 더 구체적인 마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

따라서 라만 분광법은 염색 및 라벨링 절차를 사용하지 않고 타액과 그 안에 존재하는 소포 성분의 신속하고 포괄적인 생화학적 특성화를 위한 유용한 방법으로 제안됩니다.

이 프로젝트의 목적은 다양한 실험 그룹에 대한 특정 라만 분자 시그니처를 검증하는 것입니다. 침습적이지 않은 생물학적 유체로, 신속한 감별 진단과 질병의 진행 모니터링을 위한 측정 가능한 바이오마커의 현재 부족을 채웁니다.

파킨슨병 및 비정형 파킨슨병 환자의 신속한 식별 및 감별 진단은 각 환자에게 최적의 약리학적 및 재활 요법을 신속하게 식별할 수 있게 하여 환자의 삶의 질을 크게 향상시키고 향후 질병의 진행을 늦추는 확률.

샘플 수집: 선택한 모든 대상의 타액 수집은 Salivette(SARSTEDT) 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다. 타액은 수유 및 양치질로부터 적절한 지연 시간 후에 모든 피험자로부터 얻어질 것입니다. 사전 분석 매개변수(즉, 수집과 처리 사이의 보관 온도 및 시간), 식이 및 흡연 습관이 적절하게 기록됩니다. 간단히 말해서 면봉을 입에 넣고 60초 동안 씹어 타액 분비를 자극합니다. 그런 다음 면봉을 1,000g에서 2분 동안 원심분리하여 세포 조각과 음식물 찌꺼기를 제거합니다. 수집된 샘플은 -80°C에서 보관됩니다.

샘플 처리: 라만 분석의 경우 SERS(Surface Enhanced Raman Scattering)를 달성하기 위해 각 샘플 한 방울을 알루미늄 호일에 떨어뜨립니다.

EV 격리: 효과적인 EV 격리를 위해 다양한 격리 방법이 테스트됩니다. 정제된 EV는 이전에 혈액 EV에 대해 최적화된 프로토콜에 따라 표준 기술과 라만 분광법을 통해 농축 및 분석됩니다. 실험 설정은 기판, 획득 시간 등의 변화를 고려하여 타액 EV에 맞게 조정됩니다.

데이터 수집: 타액 및 EV 스펙트럼은 785nm 및 532nm에서 작동하는 레이저 광원이 장착된 Aramis Raman 현미경(Horiba Jobin-Yvon, 프랑스)을 사용하여 수집됩니다. 기기는 520.7cm-1의 실리콘 기준 밴드를 사용하여 각 분석 전에 보정됩니다. 라만 스펙트럼은 50x 대물렌즈를 사용하여 타액의 경우 400~1600cm-1, EV의 경우 500~1800~2600~3200cm-1의 영역에서 수집됩니다. 소프트웨어 패키지 LabSpec 6(Horiba Jobin-Yvon, 프랑스)은 스펙트럼 획득에 사용됩니다.

데이터 처리: 수집된 모든 스펙트럼은 전용 소프트웨어 LabSpec 6을 사용하여 단위 벡터에 의해 기준선 수정 및 정규화됩니다. 기판의 기여도는 필요한 경우 각 스펙트럼에서 제거됩니다. 방법을 검증하기 위한 통계 분석은 다변량 분석 접근법을 사용하여 수행됩니다. 주성분 분석(PCA)은 데이터 차원을 줄이고 주요 추세를 입증하기 위해 수행됩니다. 처음 20개의 주성분(PC)은 분류 모델인 LDA(Linear Discriminant Analysis)에서 사용되어 선택한 그룹 간의 분산을 최대화하는 데이터를 구별합니다. 데이터 과적합을 방지하기 위해 가장 적은 수의 PC가 선택됩니다. LDA 모델의 방법 감도, 정밀도 및 정확도를 평가하기 위해 Leave-one-out 교차 검증 및 혼동 매트릭스 테스트가 사용됩니다. Mann-Whitney는 분석된 그룹 간의 통계적으로 관련된 차이를 확인하기 위해 PC 점수에서 수행됩니다. p-값이 0.05 미만인 계수만 유효한 상관 관계로 가정하고 Spearman's test를 사용하여 상관 및 부분 상관 분석을 수행합니다. 통계분석은 Origin2018(OriginLab, USA)을 이용하여 수행한다.

방법의 진단 가능성을 평가하기 위해 ROC 곡선이 계산됩니다.