Nyál és extracelluláris hólyagok Parkinson-kórban (RaSPiD)

A Parkinson-kór (PD) egy neurodegeneratív rendellenesség, amelyet olyan motoros tünetek jellemeznek, mint a bradykinesia, tremor, merevség és testtartási instabilitás. A páciens sajátosságait figyelembe vevő, pontos rehabilitációs program lehetővé teszi a gyógyszeres terápia hatásának maximalizálását, a beteg életminőségének javítását, valamint a betegség progressziójával összefüggő másodlagos szövődmények korlátozását. A diagnózis idején azonban különösen fontos, hogy gyorsan azonosítani lehessen az idiopátiás Parkinson-kórban szenvedőket, és meg lehessen különböztetni őket a Parkinson-kór atipikus formáiban szenvedőktől, mint például a progresszív szupranukleáris bénulás (PSP), a többszörös rendszerű atrófia (MSA). , Corticobasalis degeneráció (CBD) és Lewy-testekkel járó demencia (DLB). Az atípusos parkinsonizmusok valójában progresszív betegségek, amelyeknek bizonyos jelei és tünetei a PD-vel azonosak, azonban ezek a betegek nem reagálnak olyan hatékonyan a gyógyszeres terápiára, mivel a rájuk jellemző sejtes és degeneratív mechanizmusok nagyon eltérőek. Ezen okokból kifolyólag korai azonosításuk különösen fontos az egyes betegek számára legmegfelelőbb farmakológiai és rehabilitációs út meghatározásához.

Az egyéni komplex klinikai képet figyelembe vevő, pontosabb betegprofil-alkotás érdekében egy könnyen hozzáférhető biofluidban periodikusan mérhető biomarker felfedezése lehetővé tenné a betegek jobb rétegződését, a betegség lefolyásának nyomon követését és a kórkép alapos vizsgálatát. a farmakológiai és rehabilitációs program hatásait, személyre szabását, tekintettel a precíziós orvoslásra, amelyet a betegre terveztek, definiáltak és építettek.

A Fondazione Don Gnocchi Nanomedicina és Klinikai Biofotonika Laboratóriuma (LABION) évek óta dolgozik olyan innovatív módszereken, mint a Raman-spektroszkópia, hogy azonosítsa a neurodegeneratív betegségek biomarkereit könnyen hozzáférhető biológiai folyadékokban, például vérben és nyálban. A Raman-spektroszkópia (RS) lehetővé teszi egy adott folyadék specifikus és teljes jellemzését gyors, érzékeny és roncsolásmentes módon, anélkül, hogy különösebb eljárásokat kellene végezni az analizálandó minta előkészítésére. Az RS-ben a mintából nyert teljes spektrumot a kiválasztott minta (pl. nyál, vér, szérum, agy-gerincvelői folyadék) rendkívül specifikus „ujjlenyomataként” használják, amely a diagnosztikai biomarkert képviseli. A nyál Raman-analízise már bemutatta a progresszív patológiájú betegek jó pontosságú profiljának lehetőségét, és különösen az amiotrófiás laterális szklerózisban szenvedő betegek megkülönböztetését más típusú neurodegeneratív betegségekben szenvedőktől.

A LABION ugyanakkor igazolta a PD-ben szenvedő betegek vérében keringő extracelluláris vezikulák (EV) Raman-spektroszkópiával történő jellemzésének lehetőségét. A LABION 2017 óta dolgozik a PD-betegek szérumában keringő EV-k biokémiai vizsgálatán, az EV-k spektroszkópiás elemzésével, és bebizonyosodott, hogy az RS képes azonosítani a vérhólyagok specifikus biokémiai profilját, amely korrelál a klinikai skálákkal. UPDRS III és Hoehn and Yahr. A PD-ben szenvedő betegek nyálában jelenlévő EV-k elemzése segíthet a nyálban bekövetkező biokémiai elváltozások eredetének megértésében, valamint még specifikusabb markerek azonosításában.

Ezért a Raman-spektroszkópia hasznos módszer a nyál és a benne található hólyagos komponens gyors és átfogó biokémiai jellemzésére, festési és jelölési eljárások alkalmazása nélkül.

Ennek a projektnek a célja egy specifikus Raman molekuláris aláírás validálása a különböző kísérleti csoportok számára, amely egy olyan biomarker meghatározásához vezethet, amely alkalmas a PD-ben szenvedő emberek differenciáldiagnózisára az atipikus Parkinson-kórban szenvedő betegekhez képest, a vizsgálat elemzése révén. biológiai folyadék, amely nem invazív, így pótolja a gyors differenciáldiagnózishoz és a betegségek evolúciójának nyomon követéséhez szükséges mérhető biomarker jelenlegi hiányát.

A Parkinson-kórban és az atipikus parkinsonizmusban szenvedő alanyok gyors azonosítása és differenciáldiagnózisa lehetővé teszi az egyes alanyok számára optimális farmakológiai és rehabilitációs terápia azonnali meghatározását, ami a beteg életminőségének jelentős javulásához, a jövőben pedig fokozottabb életminőséghez vezet. annak valószínűsége, hogy lassítja a betegség progresszióját.

MINTAGYŰJTÉS: Az összes kiválasztott alany nyálgyűjtése a Salivette (SARSTEDT) gyártójának utasításait követve történik. Az etetés és a fogmosás megfelelő késleltetése után minden alany nyálat nyer. Az elemzés előtti paraméterek (pl. tárolási hőmérséklet, valamint a begyűjtés és a feldolgozás közötti idő), az étkezési és dohányzási szokásokat megfelelően rögzíteni kell. Röviden, a tampont a szájba kell helyezni, és 60 másodpercig rágni kell, hogy serkentse a nyálelválasztást. Ezután a tampont 2 percig 1000 g-vel centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a sejtfragmenseket és az ételmaradékot. Az összegyűjtött mintákat -80°C-on tároljuk.

MINTAFELDOLGOZÁS: A Raman-analízishez minden mintából egy cseppet alumíniumfóliára öntünk, hogy elérjük a Surface Enhanced Raman-szórást (SERS).

EV Izolálás: különböző szigetelési módszereket tesztelnek a hatékony EV-szigetelés érdekében. A tisztított elektromos járműveket ezután koncentrálják, és standard technikákkal, valamint Raman-spektroszkópiával elemzik, a vérelektromos járművekre korábban optimalizált protokollt követve. A kísérleti beállításokat a nyálas elektromos járművekhez kell igazítani, figyelembe véve a szubsztrátum változásait, a felvételi időt stb.

ADATGYŰJTÉS: A nyál- és EV-spektrumokat egy Aramis Raman mikroszkóppal (Horiba Jobin-Yvon, Franciaország) veszik fel, amely 785 nm-en és 532 nm-en működő lézeres fényforrással van felszerelve. A műszert minden elemzés előtt kalibrálni kell az 520,7 cm-1-es szilícium referenciasáv használatával. A Raman-spektrumokat a nyál esetében 400 és 1600 cm-1, elektromos járművek esetében 500-1800 nad 2600-3200 cm-1 közötti tartományban veszik fel 50-szeres objektív segítségével. A spektrumok felvételéhez a LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Franciaország) szoftvercsomagot használjuk.

ADATFELDOLGOZÁS: Az összes megszerzett spektrumot alapvonalon korrigáljuk és egységvektorral normalizáljuk a LabSpec 6 dedikált szoftver segítségével. A szubsztrát hozzájárulását minden egyes spektrumból eltávolítják, ha szükséges. A módszer validálására szolgáló statisztikai elemzést többváltozós elemzési megközelítéssel kell elvégezni. Az adatdimenziók csökkentése és a főbb tendenciák bizonyítása érdekében főkomponens-elemzést (PCA) végeznek. Az első 20 eredményül kapott főkomponenst (PC) egy osztályozási modellben, a Linear Discriminant Analysisben (LDA) fogják használni az adatok megkülönböztetésére, maximalizálva a kiválasztott csoportok közötti eltérést. A legkevesebb PC-t választják ki az adatok túlillesztésének elkerülése érdekében. Az LDA-modell módszer érzékenységének, pontosságának és pontosságának értékelésére az egyet elhagyó keresztellenőrzést és a zavaros mátrix tesztet használjuk. A Mann-Whitney-t PC-pontszámokon végzik el, hogy igazolják a statisztikailag releváns különbségeket az elemzett csoportok között. A korrelációs és parciális korrelációs analízist Spearman-teszttel végezzük, és csak a 0,05-nél kisebb p-értékű együtthatókat feltételezzük érvényes korrelációnak. A statisztikai elemzés az Origin2018 (OriginLab, USA) segítségével történik.

A ROC görbe kiszámítása a módszer diagnosztikai potenciáljának felmérésére szolgál.