帕金森病的唾液和细胞外囊泡 (RaSPiD)

帕金森病 (PD) 是一种神经退行性疾病，其特征是运动症状，例如运动迟缓、震颤、僵硬和姿势不稳。 考虑到患者的具体特征而设计的准确康复计划可以让您最大限度地发挥药物治疗的效果，提高患者的生活质量，同时还能限制与疾病进展相关的继发性并发症。 然而，在诊断时，能够快速识别特发性帕金森病患者并将其与非典型帕金森病患者区分开来尤为重要，例如进行性核上性麻痹 (PSP)、多系统萎缩症 (MSA) 、皮质基底节变性 (CBD) 和路易体痴呆 (DLB)。 非典型帕金森病实际上是进行性疾病，与帕金森病有一些相同的体征和症状，但是这些患者对药物治疗的反应并不那么有效，因为表征它们的细胞和退行性机制非常不同。 由于这些原因，他们的早期识别对于确定每位患者的最佳药理学和康复途径尤为重要。

为了确保考虑到个体复杂的临床情况的更准确的患者分析，发现一种可以在易于获取的生物流体中定期测量的生物标志物，将有助于更好地对患者进行分层、监测疾病进程和仔细研究药理学和康复计划的效果及其个性化，旨在为患者设计、定义和构建精准医学。

Fondazione Don Gnocchi 的纳米医学和临床生物光子学实验室 (LABION) 多年来一直致力于使用拉曼光谱等创新方法来识别血液和唾液等易于获取的生物体液中神经退行性疾病的生物标志物。 拉曼光谱 (RS) 允许以快速、灵敏和非破坏性的方式获得特定流体的特定和完整表征，而无需用于准备待分析样品的特定程序。 在 RS 中，从样本获得的整个光谱被用作所选样本（例如唾液、血液、血清、脑脊髓液）的高度特异性“指纹”，代表诊断生物标志物。 唾液的拉曼分析已经证明了可以非常准确地分析患有进行性病理的患者，特别是可以将患有肌萎缩侧索硬化症的受试者与患有其他类型神经退行性疾病的受试者区分开来。

同时，LABION验证了通过拉曼光谱表征PD患者血液中循环的细胞外囊泡（EV）的可能性。 自 2017 年以来，LABION 一直致力于通过分析光谱中的 EVs 对 PD 患者血清中的循环 EVs 进行生化研究，并证明了 RS 识别与临床量表相关的血囊泡特定生化特征的能力。 UPDRS III 以及 Hoehn 和 Yahr。 对 PD 患者唾液中存在的 EV 进行分析有助于了解唾液中生化变化的起源，并确定更具体的标记物。

因此，拉曼光谱被提议作为一种有用的方法，用于快速和全面地对唾液及其中存在的囊泡成分进行生化表征，而无需使用染色和标记程序。

该项目的目标是验证不同实验组的特定拉曼分子特征，通过分析非侵入性的生物体液，从而填补了目前缺乏用于快速鉴别诊断和监测疾病演变的可测量生物标志物的现状。

对患有帕金森病和非典型帕金森病的受试者进行快速识别和鉴别诊断，可以迅速确定每个受试者的最佳药物和康复治疗，从而显着改善患者的生活质量，并在未来增加延缓疾病进展的可能性。

样本收集：所有选定受试者的唾液收集将按照 Salivette (SARSTEDT) 制造商的说明进行。 在进食和刷牙的适当滞后时间后，将从所有受试者获得唾液。 预分析参数（即 存储温度和收集和处理之间的时间），饮食和吸烟习惯将被适当记录。 简而言之，将拭子放入口中并咀嚼 60 秒以刺激唾液分泌。 然后将拭子以 1,000 g 离心 2 分钟，以去除细胞碎片和食物残渣。 收集的样品将储存在-80°C。

样品处理：对于拉曼分析，将每个样品滴一滴在铝箔上，以实现表面增强拉曼散射 (SERS)。

EV 隔离：将测试不同的隔离方法以实现有效的 EV 隔离。 然后，纯化后的 EV 将按照先前针对血液 EV 优化的方案，通过标准技术和拉曼光谱进行浓缩和分析。 考虑到底物、采集时间等的变化，实验设置将适应唾液 EV。

数据收集：将使用 Aramis 拉曼显微镜（Horiba Jobin-Yvon，法国）获取唾液和 EV 光谱，该显微镜配备有在 785 nm 和 532 nm 下运行的激光光源。 仪器将在每次分析前使用 520.7 cm-1 处的硅参考带进行校准。 使用 50 倍物镜，将在唾液的 400 和 1600 cm-1 范围内采集拉曼光谱，对于电动汽车，在 500-1800 和 2600-3200 cm-1 范围内采集拉曼光谱。 LabSpec 6 软件包（Horiba Jobin-Yvon，法国）将用于采集光谱。

数据处理：所有获取的光谱将使用专用软件 LabSpec 6 按单位矢量进行基线校正和归一化。 如有必要，将从每个光谱中去除底物的贡献。 验证该方法的统计分析将使用多变量分析方法进行。 将执行主成分分析 (PCA) 以减少数据维度并证明主要趋势。 前 20 个生成的主成分 (PC) 将用于分类模型、线性判别分析 (LDA)，以区分数据以最大化所选组之间的方差。 将选择最少数量的 PC 以防止数据过拟合。 留一法交叉验证和混淆矩阵检验将用于评估LDA模型的方法灵敏度、精密度和准确度。 Mann-Whitney 将在 PC 分数上执行，以验证分析组之间统计相关的差异。 相关性和偏相关性分析将使用 Spearman 检验进行，假设只有 p 值低于 0.05 的系数是有效的相关性。 统计分析将使用 Origin2018 (OriginLab, USA) 进行。

将计算 ROC 曲线以评估该方法的诊断潜力。