Saliva e vesículas extracelulares para a doença de Parkinson (RaSPiD)

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por sintomas motores como bradicinesia, tremor, rigidez e instabilidade postural. Um programa de reabilitação acurado, desenhado considerando as características específicas do paciente, permite maximizar o efeito da terapia medicamentosa, melhorar a qualidade de vida do paciente, limitando também as complicações secundárias relacionadas à progressão da doença. No momento do diagnóstico, no entanto, é particularmente importante ser capaz de identificar rapidamente indivíduos com Parkinson idiopático e distingui-los daqueles que têm uma forma atípica de Parkinsonismo, como Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP), Atrofia de Sistemas Múltiplos (MSA) , Degeneração Corticobasal (CBD) e Demência com corpos de Lewy (DLB). Os parkinsonismos atípicos são de facto doenças progressivas que partilham alguns sinais e sintomas com a DP, no entanto estes doentes não respondem tão eficazmente à terapêutica medicamentosa uma vez que os mecanismos celulares e degenerativos que os caracterizam são muito diferentes. Por estas razões, a sua identificação precoce é particularmente importante para identificar a melhor via farmacológica e reabilitadora para cada doente.

Para garantir um perfil de paciente mais preciso que leve em consideração o quadro clínico complexo individual, a descoberta de um biomarcador que pode ser medido periodicamente em um biofluido facilmente acessível permitiria uma melhor estratificação do paciente, monitoramento do curso da doença e estudo cuidadoso de os efeitos do programa farmacológico e de reabilitação bem como a sua personalização, tendo em vista uma medicina de precisão pensada, definida e construída sobre o paciente.

O Laboratório de Nanomedicina e Biofotônica Clínica (LABION) da Fondazione Don Gnocchi trabalha há anos no uso de métodos inovadores, como a espectroscopia Raman, para identificar biomarcadores de doenças neurodegenerativas em fluidos biológicos facilmente acessíveis, como sangue e saliva. A Espectroscopia Raman (RS) permite obter uma caracterização específica e completa de um determinado fluido de forma rápida, sensível e não destrutiva, sem procedimentos particulares para a preparação da amostra a analisar. Na RS, todo o espectro obtido da amostra é usado como uma "impressão digital" altamente específica para a amostra selecionada (por exemplo, saliva, sangue, soro, líquido cefalorraquidiano) que representa o biomarcador de diagnóstico. A análise Raman da saliva já demonstrou a possibilidade de traçar o perfil de pacientes com patologias progressivas com boa acurácia e, especificamente, de distinguir sujeitos com esclerose lateral amiotrófica em relação a sujeitos com outros tipos de doenças neurodegenerativas.

Ao mesmo tempo, o LABION verificou a possibilidade de caracterizar por espectroscopia Raman as vesículas extracelulares (EV) circulantes no sangue de pacientes com DP. Desde 2017, o LABION trabalha no estudo bioquímico de EVs circulantes no soro de pacientes com DP, analisando os EVs em espectroscopia e foi demonstrada a capacidade do RS de identificar um perfil bioquímico específico de vesículas sanguíneas que se correlaciona com escalas clínicas. UPDRS III e Hoehn e Yahr. A análise das EVs presentes na saliva de pacientes com DP pode ajudar a entender a origem das alterações bioquímicas na saliva, bem como identificar marcadores ainda mais específicos.

A espectroscopia Raman é, portanto, proposta como um método útil para a caracterização bioquímica rápida e abrangente da saliva e do componente vesicular presente nela, sem o uso de procedimentos de coloração e rotulagem.

O objetivo deste projeto é a validação de uma assinatura molecular Raman específica para os diferentes grupos experimentais, que possa levar à determinação de um biomarcador útil para o diagnóstico diferencial de pessoas com DP em relação a indivíduos com parkinsonismo atípico, através da análise de um fluido biológico não invasivo, preenchendo assim a atual carência de um biomarcador mensurável para diagnóstico diferencial rápido e acompanhamento da evolução das doenças.

A rápida identificação e diagnóstico diferencial de indivíduos com doença de Parkinson e parkinsonismos atípicos permitirá identificar rapidamente a terapêutica farmacológica e reabilitadora óptima para cada indivíduo, conduzindo a uma melhoria significativa da qualidade de vida do doente e, futuramente, a um aumento probabilidade de retardar a progressão da doença.

COLETA DE AMOSTRA: A coleta de saliva de todos os indivíduos selecionados será realizada seguindo as instruções do fabricante do Salivette (SARSTEDT). A saliva será obtida de todos os indivíduos após um intervalo de tempo apropriado entre a alimentação e a escovação dos dentes. Parâmetros pré-analíticos (ou seja, temperatura de armazenamento e tempo entre coleta e processamento), hábitos alimentares e tabágicos serão devidamente registrados. Resumidamente, o swab será colocado na boca e mastigado por 60 segundos para estimular a salivação. Em seguida, o swab será centrifugado por 2 minutos a 1.000 g para remover fragmentos de células e restos de alimentos. As amostras coletadas serão armazenadas a -80° C.

PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: Para a análise Raman, uma gota de cada amostra será moldada em uma folha de alumínio para obter o Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

ISOLAMENTO EV: diferentes métodos de isolamento serão testados para isolamento EV eficaz. As EVs purificadas serão então concentradas e analisadas por meio de técnicas padrão e por espectroscopia Raman seguindo um protocolo previamente otimizado para EVs de sangue. As configurações experimentais serão adaptadas aos EVs salivares, considerando variações de substrato, tempo de aquisição, etc.

COLETA DE DADOS: Os espectros salivares e EV serão adquiridos usando um microscópio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, França) equipado com uma fonte de luz laser operando em 785 nm e 532 nm. O instrumento será calibrado antes de cada análise usando a banda de referência de silício em 520,7 cm-1. Os espectros Raman serão adquiridos na região entre 400 e 1600 cm-1 para saliva, 500-1800 nad 2600-3200 cm-1 para EVs usando uma objetiva de 50x. O pacote de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, França) será utilizado para a aquisição dos espectros.

PROCESSAMENTO DE DADOS: Todos os espectros adquiridos serão corrigidos pela linha de base e normalizados por vetor unitário usando o software dedicado LabSpec 6. A contribuição do substrato será removida de cada espectro, se necessário. A análise estatística para validar o método será realizada utilizando uma abordagem de análise multivariada. A análise de componentes principais (PCA) será realizada para reduzir as dimensões dos dados e evidenciar as principais tendências. Os primeiros 20 Componentes Principais (CPs) resultantes serão utilizados em um modelo de classificação, Análise Discriminante Linear (LDA), para discriminar os dados maximizando a variância entre os grupos selecionados. O menor número de PCs será selecionado para evitar o superajuste dos dados. A validação cruzada leave-one-out e o teste da matriz de confusão serão utilizados para avaliar a sensibilidade, precisão e exatidão do método do modelo LDA. Os escores de Mann-Whitney serão realizados nos PCs para verificar as diferenças estatisticamente relevantes entre os grupos analisados. A análise de correlação e correlação parcial será realizada por meio do teste de Spearman, assumindo como correlação válida apenas os coeficientes com p-valor inferior a 0,05. A análise estatística será realizada no Origin2018 (OriginLab, EUA).

A Curva ROC será calculada para avaliar o potencial diagnóstico do método.