Saliv och extracellulära blåsor för Parkinsons sjukdom (RaSPiD)

Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ störning som kännetecknas av motoriska symtom som bradykinesi, tremor, stelhet och postural instabilitet. Ett noggrant rehabiliteringsprogram utformat med hänsyn till patientens specifika egenskaper gör att du kan maximera effekten av läkemedelsbehandling, förbättra patientens livskvalitet och samtidigt begränsa sekundära komplikationer relaterade till sjukdomens fortskridande. Vid diagnostillfället är det dock särskilt viktigt att snabbt kunna identifiera individer med idiopatisk Parkinson och särskilja dem från dem som har en atypisk form av Parkinsonism, såsom progressiv supranukleär pares (PSP), multipel systematrofi (MSA). , kortikobasal degeneration (CBD) och demens med Lewy-kroppar (DLB). Atypiska Parkinsonisms är faktiskt progressiva sjukdomar som delar vissa tecken och symtom med PD, men dessa patienter svarar inte lika effektivt på läkemedelsbehandling eftersom de cellulära och degenerativa mekanismerna som kännetecknar dem är mycket olika. Av dessa skäl är deras tidig identifiering särskilt viktig för att identifiera den bästa farmakologiska och rehabiliterande vägen för varje patient.

För att säkerställa en mer exakt patientprofilering som tar hänsyn till den individuella komplexa kliniska bilden, skulle upptäckten av en biomarkör som periodiskt kan mätas i en lättillgänglig biovätska möjliggöra bättre patientstratifiering, övervakning av sjukdomsförloppet och noggranna studier av effekterna av det farmakologiska och rehabiliteringsprogrammet samt dess personalisering, med sikte på precisionsmedicin utformad, definierad och byggd på patienten.

Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) av Fondazione Don Gnocchi har arbetat i flera år med att använda innovativa metoder som Raman-spektroskopi för att identifiera biomarkörer för neurodegenerativa sjukdomar i lättillgängliga biologiska vätskor, såsom blod och saliv. Raman-spektroskopi (RS) gör det möjligt att erhålla en specifik och fullständig karakterisering av en specifik vätska på ett snabbt, känsligt och oförstörande sätt, utan särskilda procedurer för beredning av provet som ska analyseras. I RS används hela spektrumet som erhålls från provet som ett mycket specifikt "fingeravtryck" för det valda provet (t.ex. saliv, blod, serum, cerebrospinalvätska) som representerar den diagnostiska biomarkören. Raman-analysen av saliv har redan visat möjligheten att profilera patienter med progressiva patologier med god noggrannhet och, specifikt, att särskilja patienter som lider av amyotrofisk lateralskleros jämfört med patienter med andra typer av neurodegenerativa sjukdomar.

Samtidigt har LABION verifierat möjligheten att genom Raman-spektroskopi karakterisera de extracellulära vesiklar (EV) som cirkulerar i blodet hos patienter med PD. Sedan 2017 har LABION arbetat med den biokemiska studien av cirkulerande elbilar i serum från PD-patienter genom att analysera elbilar i spektroskopi och förmågan hos RS att identifiera en specifik biokemisk profil av blodvesiklar som korrelerar med kliniska skalor har visats. UPDRS III och Hoehn och Yahr. Analysen av de elbilar som finns i saliven hos patienter med PD kan hjälpa till att förstå ursprunget till biokemiska förändringar i saliven samt identifiera ännu mer specifika markörer.

Ramanspektroskopi föreslås därför som en användbar metod för snabb och omfattande biokemisk karakterisering av saliv och den vesikulära komponenten som finns i den, utan användning av färgnings- och märkningsprocedurer.

Målet med detta projekt är att validera en specifik Raman molekylär signatur för de olika experimentella grupperna, vilket kan leda till bestämning av en biomarkör användbar för differentialdiagnos av personer med PD jämfört med patienter med atypisk Parkinsonism, genom analys av en biologisk vätska som inte är invasiv, vilket fyller den nuvarande bristen på en mätbar biomarkör för snabb differentialdiagnos och för att övervaka utvecklingen av sjukdomarna.

Den snabba identifieringen och differentialdiagnosen av patienter med Parkinsons sjukdom och atypiska parkinsonismer kommer att göra det möjligt att snabbt identifiera den optimala farmakologiska och rehabiliterande behandlingen för varje patient, vilket leder till en betydande förbättring av livskvaliteten för patienten och, i framtiden, en ökad sannolikhet bromsar utvecklingen av sjukdomen.

PROVINSAMLING: Salivuppsamling från alla utvalda försökspersoner kommer att utföras enligt Salivette (SARSTEDT) tillverkarens instruktioner. Saliv kommer att erhållas från alla försökspersoner efter en lämplig fördröjningstid från matning och tandborstning. Preanalytiska parametrar (dvs. lagringstemperatur och tid mellan insamling och bearbetning), kommer kost- och rökvanor att registreras korrekt. Kortfattat kommer pinnen placeras i munnen och tuggas i 60 sekunder för att stimulera salivutsöndring. Sedan kommer provtagningspinnen att centrifugeras i 2 minuter vid 1 000 g för att avlägsna cellfragment och matrester. Insamlade prover kommer att förvaras vid -80°C.

PROVBEHANDLING: För Raman-analysen kommer en droppe av varje prov att gjutas på en aluminiumfolie för att uppnå Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

EV ISOLATION: olika isoleringsmetoder kommer att testas för effektiv EV-isolering. Renade elbilar kommer sedan att koncentreras och analyseras med hjälp av standardtekniker och genom Raman-spektroskopi enligt ett tidigare optimerat protokoll för elbilar i blod. De experimentella inställningarna kommer att anpassas till salivelektroniska fordon, med hänsyn till variationer i substrat, anskaffningstid, etc.

DATAINSAMLING: Saliv- och EV-spektra kommer att förvärvas med ett Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utrustat med en laserljuskälla som arbetar vid 785 nm och 532 nm. Instrumentet kommer att kalibreras före varje analys med hjälp av referensbandet av kisel vid 520,7 cm-1. Raman-spektra kommer att förvärvas i området mellan 400 och 1600 cm-1 för saliv, 500-1800 och 2600-3200 cm-1 för elbilar med ett 50x objektiv. Mjukvarupaketet LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) kommer att användas för förvärvet av spektra.

DATABEHANDLING: Alla inhämtade spektra kommer att korrigeras för baslinje och normaliseras av enhetsvektor med hjälp av den dedikerade programvaran LabSpec 6. Bidraget från substratet kommer att tas bort från varje spektra, om nödvändigt. Den statistiska analysen för att validera metoden kommer att utföras med hjälp av en multivariat analysmetod. Principal Component Analysis (PCA) kommer att utföras för att minska datadimensionerna och för att bevisa stora trender. De första 20 resulterande huvudkomponenterna (PC) kommer att användas i en klassificeringsmodell, Linear Discriminant Analysis (LDA), för att särskilja data för att maximera variansen mellan de valda grupperna. Det minsta antalet datorer kommer att väljas för att förhindra att data överanpassas. Lämna-en-ut korsvalidering och förvirringsmatristest kommer att användas för att utvärdera metodens känslighet, precision och noggrannhet hos LDA-modellen. Mann-Whitney kommer att utföras på PCs poäng för att verifiera skillnaderna statistiskt relevanta mellan de analyserade grupperna. Korrelations- och partiell korrelationsanalys kommer att utföras med användning av Spearmans test, med antagande som giltig korrelation endast koefficienter med ett p-värde lägre än 0,05. Den statistiska analysen kommer att utföras med Origin2018 (OriginLab, USA).

ROC-kurvan kommer att beräknas för att bedöma metodens diagnostiska potential.