Saliva y vesículas extracelulares para la enfermedad de Parkinson (RaSPiD)

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por síntomas motores como bradicinesia, temblor, rigidez e inestabilidad postural. Un programa de rehabilitación preciso diseñado teniendo en cuenta las características específicas del paciente le permite maximizar el efecto de la terapia con medicamentos, mejorar la calidad de vida del paciente y, al mismo tiempo, limitar las complicaciones secundarias relacionadas con la progresión de la enfermedad. Sin embargo, en el momento del diagnóstico, es particularmente importante poder identificar rápidamente a las personas con Parkinson idiopático y distinguirlas de aquellas que tienen una forma atípica de parkinsonismo, como parálisis supranuclear progresiva (PSP), atrofia multisistémica (MSA) , Degeneración corticobasal (CBD) y Demencia con cuerpos de Lewy (DLB). Los parkinsonismos atípicos son en realidad enfermedades progresivas que comparten algunos signos y síntomas con la EP, sin embargo estos pacientes no responden tan eficazmente a la terapia farmacológica ya que los mecanismos celulares y degenerativos que los caracterizan son muy diferentes. Por estas razones, su identificación temprana es particularmente importante para identificar el mejor camino farmacológico y rehabilitador para cada paciente.

Para garantizar un perfil de paciente más preciso que tenga en cuenta el complejo cuadro clínico individual, el descubrimiento de un biomarcador que pueda medirse periódicamente en un biofluido de fácil acceso permitiría una mejor estratificación de los pacientes, el seguimiento del curso de la enfermedad y un estudio cuidadoso de los efectos del programa farmacológico y rehabilitador así como su personalización, con miras a una medicina de precisión diseñada, definida y construida sobre el paciente.

El Laboratorio de Nanomedicina y Biofotónica Clínica (LABION) de la Fondazione Don Gnocchi trabaja desde hace años en el uso de métodos innovadores como la espectroscopia Raman para identificar biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas en fluidos biológicos de fácil acceso, como la sangre y la saliva. La Espectroscopía Raman (RS) permite obtener una caracterización específica y completa de un fluido específico de forma rápida, sensible y no destructiva, sin procedimientos particulares para la preparación de la muestra a analizar. En RS, todo el espectro obtenido de la muestra se utiliza como una "huella digital" altamente específica para la muestra seleccionada (p. ej., saliva, sangre, suero, líquido cefalorraquídeo) que representa el biomarcador de diagnóstico. El análisis Raman de la saliva ya ha demostrado la posibilidad de perfilar pacientes con patologías progresivas con buena precisión y, en concreto, de distinguir sujetos que padecen esclerosis lateral amiotrófica frente a sujetos con otro tipo de enfermedades neurodegenerativas.

Al mismo tiempo, LABION ha comprobado la posibilidad de caracterizar por espectroscopia Raman, las vesículas extracelulares (EV) que circulan en la sangre de pacientes con EP. Desde 2017, LABION ha estado trabajando en el estudio bioquímico de los EV circulantes en el suero de pacientes con EP mediante el análisis de los EV en espectroscopia y se ha demostrado la capacidad de RS para identificar un perfil bioquímico específico de vesículas sanguíneas que se correlaciona con escalas clínicas. UPDRS III y Hoehn y Yahr. El análisis de las EV presentes en la saliva de pacientes con EP podría ayudar a comprender el origen de las alteraciones bioquímicas en la saliva así como a identificar marcadores aún más específicos.

Por lo tanto, la espectroscopia Raman se propone como un método útil para la caracterización bioquímica rápida y completa de la saliva y el componente vesicular presente en ella, sin el uso de procedimientos de tinción y etiquetado.

El objetivo de este proyecto es la validación de una firma molecular Raman específica para los diferentes grupos experimentales, que pueda conducir a la determinación de un biomarcador útil para el diagnóstico diferencial de personas con EP frente a sujetos con parkinsonismo atípico, mediante el análisis de un fluido biológico que no sea invasivo, cubriendo así la carencia actual de un biomarcador medible para el diagnóstico diferencial rápido y para el seguimiento de la evolución de las enfermedades.

La rápida identificación y diagnóstico diferencial de los sujetos con enfermedad de Parkinson y parkinsonismos atípicos permitirá identificar oportunamente la terapia farmacológica y rehabilitadora óptima para cada sujeto, lo que redundará en una mejora significativa de la calidad de vida del paciente y, en el futuro, en una mayor probabilidad de retardar la progresión de la enfermedad.

RECOGIDA DE MUESTRAS: La recogida de saliva de todos los sujetos seleccionados se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante de Salivette (SARSTEDT). La saliva se obtendrá de todos los sujetos después de un tiempo de retraso adecuado desde la alimentación y el cepillado de dientes. Parámetros preanalíticos (es decir, la temperatura de almacenamiento y el tiempo entre la recolección y el procesamiento), se registrará adecuadamente el hábito dietético y de tabaquismo. Brevemente, el hisopo se colocará en la boca y se masticará durante 60 segundos para estimular la salivación. Luego se centrifugará el hisopo durante 2 minutos a 1.000 g para eliminar fragmentos de células y restos de comida. Las muestras recolectadas se almacenarán a -80° C.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Para el análisis Raman, una gota de cada muestra se vaciará sobre una lámina de aluminio para lograr la Dispersión Raman Mejorada en la Superficie (SERS).

AISLAMIENTO EV: se probarán diferentes métodos de aislamiento para un aislamiento EV efectivo. Los EV purificados serán luego concentrados y analizados mediante técnicas estándar y por espectroscopia Raman siguiendo un protocolo previamente optimizado para EV en sangre. Los ajustes experimentales se adaptarán a los EV salivales, considerando variaciones en el sustrato, tiempo de adquisición, etc.

RECOLECCIÓN DE DATOS: Los espectros de saliva y EV se adquirirán utilizando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) equipado con una fuente de luz láser que opera a 785 nm y 532 nm. El instrumento será calibrado antes de cada análisis utilizando la banda de referencia de silicio a 520,7 cm-1. Los espectros Raman se adquirirán en la región entre 400 y 1600 cm-1 para saliva, 500-1800 y 2600-3200 cm-1 para EV utilizando un objetivo de 50x. El paquete de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francia) se utilizará para la adquisición de espectros.

PROCESAMIENTO DE DATOS: Todos los espectros adquiridos serán corregidos en línea base y normalizados por vector unitario usando el software dedicado LabSpec 6. La contribución del sustrato se eliminará de cada espectro, si es necesario. El análisis estadístico para validar el método se realizará utilizando un enfoque de análisis multivariante. Se realizará un análisis de componentes principales (PCA) para reducir las dimensiones de los datos y evidenciar las principales tendencias. Los primeros 20 Componentes Principales (PC) resultantes se utilizarán en un modelo de clasificación, Análisis Discriminante Lineal (LDA), para discriminar los datos maximizando la varianza entre los grupos seleccionados. Se seleccionará el menor número de PC para evitar el sobreajuste de datos. Se utilizará la validación cruzada de exclusión y la prueba de matriz de confusión para evaluar la sensibilidad, la precisión y la exactitud del método del modelo LDA. Mann-Whitney se realizará en puntajes de PC para verificar las diferencias estadísticamente relevantes entre los grupos analizados. El análisis de correlación y correlación parcial se realizará mediante la prueba de Spearman, asumiendo como correlación válida únicamente los coeficientes con un valor de p inferior a 0,05. El análisis estadístico se realizará utilizando Origin2018 (OriginLab, EE. UU.).

Se calculará la curva ROC para evaluar el potencial de diagnóstico del método.