Sylki ja solunulkoiset rakkulat Parkinsonin taudin hoitoon (RaSPiD)

Parkinsonin tauti (PD) on neurodegeneratiivinen sairaus, jolle on tunnusomaista motoriset oireet, kuten bradykinesia, vapina, jäykkyys ja asennon epävakaus. Tarkka kuntoutusohjelma, joka on suunniteltu ottaen huomioon potilaan erityispiirteet, mahdollistaa lääkehoidon tehon maksimoimisen, potilaan elämänlaadun parantamisen ja samalla myös taudin etenemiseen liittyvien toissijaisten komplikaatioiden rajoittamisen. Diagnoosin yhteydessä on kuitenkin erityisen tärkeää pystyä tunnistamaan nopeasti yksilöt, joilla on idiopaattinen Parkinsonin tauti, ja erottaa heidät niistä, joilla on epätyypillinen Parkinsonin muoto, kuten progressiivinen supranukleaarinen halvaus (PSP), monijärjestelmäatrofia (MSA). , kortikobasaalinen rappeuma (CBD) ja dementia Lewyn kappaleilla (DLB). Epätyypilliset parkinsonismit ovat itse asiassa progressiivisia sairauksia, joilla on yhteisiä merkkejä ja oireita PD:n kanssa, mutta nämä potilaat eivät kuitenkaan reagoi yhtä tehokkaasti lääkehoitoon, koska niille ominaiset solu- ja rappeutumismekanismit ovat hyvin erilaisia. Näistä syistä niiden varhainen tunnistaminen on erityisen tärkeää parhaan farmakologisen ja kuntouttavan polun tunnistamiseksi kullekin potilaalle.

Tarkemman ja yksilöllisen monimutkaisen kliinisen kuvan huomioon ottavan potilasprofiloinnin varmistamiseksi biomarkkerin löytäminen, joka voidaan säännöllisesti mitata helposti saatavilla olevasta bionesteestä, mahdollistaisi potilaiden paremman kerrostumisen, taudin kulun seurannan ja huolellisen tutkimuksen farmakologisen ja kuntoutusohjelman vaikutukset sekä sen personointi potilaalle suunniteltua, määriteltyä ja rakennettua tarkkuuslääkettä silmällä pitäen.

Fondazione Don Gnocchin nanolääketieteen ja kliinisen biofotoniikan laboratorio (LABION) on työskennellyt vuosia innovatiivisten menetelmien, kuten Raman-spektroskopian, avulla tunnistaakseen hermostoa rappeuttavien sairauksien biomarkkereita helposti saatavilla olevista biologisista nesteistä, kuten verestä ja syljestä. Raman-spektroskopia (RS) mahdollistaa tietyn nesteen spesifisen ja täydellisen karakterisoinnin nopealla, herkällä ja tuhoamattomalla tavalla ilman erityisiä toimenpiteitä analysoitavan näytteen valmistelussa. RS:ssä näytteestä saatua koko spektriä käytetään erittäin spesifisenä "sormenjäljenä" valitulle näytteelle (esim. sylki, veri, seerumi, aivo-selkäydinneste), joka edustaa diagnostista biomarkkeria. Syljen Raman-analyysi on jo osoittanut mahdollisuuden profiloida potilaat, joilla on etenevä patologia hyvällä tarkkuudella, ja erityisesti erottaa amyotrofisesta lateraaliskleroosista kärsivät kohteet verrattuna henkilöihin, joilla on muuntyyppisiä hermostoa rappeuttavia sairauksia.

Samaan aikaan LABION on varmistanut mahdollisuuden karakterisoida Raman-spektroskopialla PD-potilaiden veressä kiertäviä solunulkoisia rakkuloita (EV). Vuodesta 2017 lähtien LABION on työskennellyt PD-potilaiden seerumissa kiertävien EV:iden biokemiallisen tutkimuksen parissa analysoimalla EV:itä spektroskopialla, ja RS:n kyky tunnistaa verirakkuloiden spesifinen biokemiallinen profiili, joka korreloi kliinisten asteikkojen kanssa, on osoitettu. UPDRS III ja Hoehn and Yahr. PD:tä sairastavien potilaiden syljessä olevien EV:iden analysointi voisi auttaa ymmärtämään syljen biokemiallisten muutosten alkuperää sekä tunnistamaan vielä tarkempia markkereita.

Raman-spektroskopiaa ehdotetaan siksi hyödylliseksi menetelmäksi syljen ja siinä olevan vesikulaarikomponentin nopeaan ja kattavaan biokemialliseen karakterisointiin ilman värjäys- ja leimausmenetelmiä.

Tämän projektin tavoitteena on validoida spesifinen Raman-molekyyliallekirjoitus eri koeryhmille, mikä voi johtaa biomarkkerin määrittämiseen, joka on hyödyllinen PD-potilaiden erotusdiagnoosissa verrattuna potilaisiin, joilla on epätyypillinen parkinsonismi. biologista nestettä, joka ei ole invasiivinen, mikä täyttää nykyisen mitattavissa olevan biomarkkerin puutteen nopeaa erotusdiagnoosia ja sairauksien kehityksen seurantaa varten.

Parkinsonin tautia ja epätyypillisiä parkinsonismia sairastavien henkilöiden nopea tunnistaminen ja erotusdiagnoosi mahdollistaa kullekin tutkittavalle optimaalisen farmakologisen ja kuntouttavan hoidon nopean tunnistamisen, mikä parantaa merkittävästi potilaan elämänlaatua ja tulevaisuudessa todennäköisyys hidastaa taudin etenemistä.

NÄYTTEEN KERÄÄMINEN: Syljenkeruu kaikilta valituilta koehenkilöiltä suoritetaan Salivetten (SARSTEDT) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikilta koehenkilöiltä saadaan sylkeä sopivan viiveen jälkeen ruokinnasta ja hampaiden harjauksesta. Esianalyyttiset parametrit (esim. varastointilämpötila ja aika keräyksen ja käsittelyn välillä), ruokavalio- ja tupakointitottumukset kirjataan asianmukaisesti. Lyhyesti sanottuna vanupuikko asetetaan suuhun ja sitä pureskellaan 60 sekunnin ajan syljenerityksen stimuloimiseksi. Sen jälkeen vanupuikkoa sentrifugoidaan 2 minuuttia 1 000 g:ssä solufragmenttien ja ruokajätteiden poistamiseksi. Kerätyt näytteet säilytetään -80°C:ssa.

NÄYTTEEN KÄSITTELY: Raman-analyysiä varten pisara kutakin näytettä valetaan alumiinifoliolle, jotta saavutetaan Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

EV-ERISTYS: eri eristysmenetelmiä testataan tehokkaan EV-eristyksen varmistamiseksi. Puhdistetut sähköajoneuvot väkevöidään ja analysoidaan vakiotekniikoilla ja Raman-spektroskopialla noudattaen aiemmin optimoitua protokollaa veren EV:ille. Kokeelliset asetukset mukautetaan sylkeä erittäviin sähköautoihin ottaen huomioon vaihtelut substraatissa, hankinta-ajan jne.

TIETOJEN KERÄÄMINEN: Sylki- ja EV-spektrit hankitaan käyttämällä Aramis Raman -mikroskooppia (Horiba Jobin-Yvon, Ranska), joka on varustettu laservalonlähteellä, joka toimii aallonpituudella 785 nm ja 532 nm. Instrumentti kalibroidaan ennen jokaista analyysiä käyttäen piiviittanauhaa 520,7 cm-1. Raman-spektrit hankitaan alueelta 400-1600 cm-1 syljen osalta ja 500-1800 nad 2600-3200 cm-1 sähköajoneuvojen alueella käyttämällä 50x objektiivia. Spektrien hankinnassa käytetään ohjelmistopakettia LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Ranska).

TIETOJEN KÄSITTELY: Kaikki saadut spektrit perusviiva korjataan ja normalisoidaan yksikkövektorilla käyttämällä erityistä LabSpec 6 -ohjelmistoa. Substraatin osuus poistetaan tarvittaessa jokaisesta spektristä. Tilastollinen analyysi menetelmän validoimiseksi suoritetaan käyttämällä monimuuttujaanalyysin lähestymistapaa. Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritetaan tietojen mittasuhteiden pienentämiseksi ja tärkeimpien suuntausten osoittamiseksi. Ensimmäisiä 20 tuloksena olevaa pääkomponenttia (PC:tä) käytetään luokitusmallissa, Linear Discriminant Analysis (LDA) -mallissa datan erottelemiseksi ja maksimoimalla varianssin valittujen ryhmien välillä. Pienin määrä tietokoneita valitaan tietojen ylisovittamisen estämiseksi. LDA-mallin menetelmän herkkyyden, tarkkuuden ja tarkkuuden arviointiin käytetään Leave-one-out-ristivalidointia ja sekavuusmatriisitestiä. Mann-Whitney suoritetaan PC-pisteillä analysoitujen ryhmien tilastollisesti merkityksellisten erojen tarkistamiseksi. Korrelaatio- ja osittaiskorrelaatioanalyysi suoritetaan Spearmanin testiä käyttäen, kun oletetaan päteväksi korrelaatioksi vain kertoimet, joiden p-arvo on pienempi kuin 0,05. Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttämällä Origin2018:aa (OriginLab, USA).

ROC-käyrä lasketaan menetelmän diagnostisen potentiaalin arvioimiseksi.