Spyt og ekstracellulære vesikler til Parkinsons sygdom (RaSPiD)

Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ lidelse karakteriseret ved motoriske symptomer som bradykinesi, tremor, stivhed og postural ustabilitet. Et nøjagtigt rehabiliteringsprogram designet under hensyntagen til patientens specifikke karakteristika giver dig mulighed for at maksimere effekten af ​​lægemiddelbehandling, forbedre patientens livskvalitet, samtidig med at det begrænser sekundære komplikationer relateret til sygdommens progression. På diagnosetidspunktet er det dog særligt vigtigt hurtigt at kunne identificere personer med idiopatisk Parkinson og skelne dem fra dem, der har en atypisk form for Parkinsonisme, såsom progressiv supranukleær parese (PSP), multipel systematrofi (MSA). , Corticobasal Degeneration (CBD) og Demens med Lewy-legemer (DLB). Atypiske Parkinsonisme er faktisk progressive sygdomme, der deler nogle tegn og symptomer med PD, men disse patienter reagerer ikke så effektivt på lægemiddelbehandling, da de cellulære og degenerative mekanismer, der karakteriserer dem, er meget forskellige. Af disse grunde er deres tidlige identifikation særlig vigtig for at identificere den bedste farmakologiske og rehabiliterende vej for hver patient.

For at sikre en mere præcis patientprofilering, der tager højde for det individuelle komplekse kliniske billede, vil opdagelsen af ​​en biomarkør, der periodisk kan måles i en let tilgængelig biovæske, give mulighed for bedre patientstratificering, overvågning af sygdomsforløbet og omhyggelig undersøgelse af effekterne af det farmakologiske og rehabiliterende program samt dets personalisering med henblik på præcisionsmedicin designet, defineret og bygget på patienten.

Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) af Fondazione Don Gnocchi har i årevis arbejdet på at bruge innovative metoder såsom Raman-spektroskopi til at identificere biomarkører for neurodegenerative sygdomme i let tilgængelige biologiske væsker, såsom blod og spyt. Raman-spektroskopi (RS) gør det muligt at opnå en specifik og fuldstændig karakterisering af en specifik væske på en hurtig, følsom og ikke-destruktiv måde uden særlige procedurer til forberedelse af prøven, der skal analyseres. I RS bruges hele spektret opnået fra prøven som et meget specifikt "fingeraftryk" for den udvalgte prøve (f.eks. spyt, blod, serum, cerebrospinalvæske), som repræsenterer den diagnostiske biomarkør. Raman-analysen af ​​spyt har allerede demonstreret muligheden for at profilere patienter med progressive patologier med god nøjagtighed og specifikt at skelne individer, der lider af amyotrofisk lateral sklerose, sammenlignet med forsøgspersoner med andre typer neurodegenerative sygdomme.

Samtidig har LABION verificeret muligheden for ved Raman-spektroskopi at karakterisere de ekstracellulære vesikler (EV), der cirkulerer i blodet hos patienter med PD. Siden 2017 har LABION arbejdet på den biokemiske undersøgelse af cirkulerende EV'er i serum fra PD-patienter ved at analysere EV'erne i spektroskopi, og RS's evne til at identificere en specifik biokemisk profil af blodvesikler, der korrelerer med kliniske skalaer, er blevet demonstreret. UPDRS III og Hoehn og Yahr. Analysen af ​​de elbiler, der er til stede i spyttet hos patienter med PD, kunne hjælpe med at forstå oprindelsen af ​​biokemiske ændringer i spyttet samt identificere endnu mere specifikke markører.

Raman-spektroskopi foreslås derfor som en nyttig metode til hurtig og omfattende biokemisk karakterisering af spyt og den vesikulære komponent, der er til stede i det, uden brug af farvnings- og mærkningsprocedurer.

Formålet med dette projekt er validering af en specifik Raman molekylær signatur for de forskellige eksperimentelle grupper, som kan føre til bestemmelse af en biomarkør, der er nyttig til differentialdiagnose af mennesker med PD sammenlignet med forsøgspersoner med atypisk Parkinsonisme, gennem analyse af en biologisk væske, der ikke er invasiv, og dermed fylder den nuværende mangel på en målbar biomarkør til hurtig differentialdiagnose og til overvågning af sygdommenes udvikling.

Den hurtige identifikation og differentialdiagnose af personer med Parkinsons sygdom og atypiske parkinsonismer vil gøre det muligt hurtigt at identificere den optimale farmakologiske og rehabiliterende terapi for hvert individ, hvilket fører til en væsentlig forbedring af livskvaliteten for patienten og i fremtiden en øget sandsynlighed for at bremse udviklingen af ​​sygdommen.

PRØVEINDSAMLING: Spytopsamling fra alle de udvalgte forsøgspersoner vil blive udført efter Salivette (SARSTEDT) producentens instruktioner. Spyt vil blive opnået fra alle forsøgspersoner efter en passende forsinkelsestid fra fodring og tandbørstning. Præanalytiske parametre (dvs. opbevaringstemperatur og tid mellem indsamling og behandling), vil kost- og rygevaner blive korrekt registreret. Kort sagt vil podepinden blive lagt i munden og tygget i 60 sekunder for at stimulere spytudskillelsen. Derefter vil podepinden blive centrifugeret i 2 minutter ved 1.000 g for at fjerne cellefragmenter og madrester. Indsamlede prøver vil blive opbevaret ved -80°C.

PRØVEBEHANDLING: Til Raman-analysen vil en dråbe af hver prøve blive støbt på en aluminiumsfolie for at opnå Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

EV ISOLATION: Forskellige isoleringsmetoder vil blive testet for effektiv EV-isolering. Oprensede EV'er vil derefter blive koncentreret og analyseret ved hjælp af standardteknikker og ved Raman-spektroskopi efter en tidligere optimeret protokol for EV'er i blod. De eksperimentelle indstillinger vil blive tilpasset til spyt-EV'erne under hensyntagen til variationer i substrat, anskaffelsestid osv.

DATAINDSAMLING: Spyt- og EV-spektre vil blive erhvervet ved hjælp af et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrig) udstyret med en laserlyskilde, der opererer ved 785 nm og 532 nm. Instrumentet vil blive kalibreret før hver analyse ved hjælp af referencebåndet for silicium ved 520,7 cm-1. Raman-spektre vil blive erhvervet i området mellem 400 og 1600 cm-1 for spyt, 500-1800 og 2600-3200 cm-1 for elbiler ved hjælp af et 50x objektiv. Softwarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrig) vil blive brugt til opkøb af spektre.

DATABEHANDLING: Alle de erhvervede spektre vil blive baseline-korrigeret og normaliseret af enhedsvektor ved hjælp af den dedikerede software LabSpec 6. Bidraget fra substratet vil blive fjernet fra hvert spektre, hvis det er nødvendigt. Den statistiske analyse for at validere metoden vil blive udført ved hjælp af en multivariat analysetilgang. Principal Component Analysis (PCA) vil blive udført for at reducere datadimensioner og bevise store tendenser. De første 20 resulterende Principal Components (PC'er) vil blive brugt i en klassifikationsmodel, Linear Discriminant Analysis (LDA), for at skelne dataene, hvilket maksimerer variansen mellem de udvalgte grupper. Det mindste antal pc'er vil blive valgt for at forhindre dataovertilpasning. Leave-one-out krydsvalidering og konfusionsmatrixtest vil blive brugt til at evaluere metodefølsomheden, præcisionen og nøjagtigheden af ​​LDA-modellen. Mann-Whitney vil blive udført på pcs score for at verificere forskellene statistisk relevante mellem de analyserede grupper. Korrelations- og partiel korrelationsanalyse vil blive udført ved hjælp af Spearman's test, idet det antages som gyldig korrelation kun koefficienter med en p-værdi lavere end 0,05. Den statistiske analyse vil blive udført ved hjælp af Origin2018 (OriginLab, USA).

ROC-kurven vil blive beregnet for at vurdere metodens diagnostiske potentiale.