Ślina i pęcherzyki pozakomórkowe w chorobie Parkinsona (RaSPiD)

Choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się objawami motorycznymi, takimi jak spowolnienie ruchowe, drżenie, sztywność i niestabilność postawy. Trafny program rehabilitacji opracowany z uwzględnieniem specyfiki pacjenta pozwala zmaksymalizować efekt farmakoterapii, poprawić jakość życia pacjenta, a także ograniczyć wtórne powikłania związane z progresją choroby. Jednak w momencie diagnozy szczególnie ważna jest możliwość szybkiej identyfikacji osób z idiopatyczną chorobą Parkinsona i odróżnienia ich od osób z atypową postacią parkinsonizmu, taką jak postępujące porażenie nadjądrowe (PSP), zanik wielu układów (MSA). , zwyrodnienie korowo-podstawne (CBD) i otępienie z ciałami Lewy'ego (DLB). Atypowe parkinsonizmy są w rzeczywistości postępującymi chorobami, które mają wspólne objawy przedmiotowe i podmiotowe z PD, jednak ci pacjenci nie reagują tak skutecznie na terapię lekową, ponieważ charakteryzujące ich mechanizmy komórkowe i zwyrodnieniowe są bardzo różne. Z tych powodów ich wczesna identyfikacja jest szczególnie ważna dla określenia najlepszej ścieżki farmakologicznej i rehabilitacyjnej dla każdego pacjenta.

Aby zapewnić dokładniejsze profilowanie pacjentów, uwzględniające indywidualny złożony obraz kliniczny, odkrycie biomarkera, który można okresowo mierzyć w łatwo dostępnym biopłynie, pozwoliłoby na lepszą stratyfikację pacjentów, monitorowanie przebiegu choroby i dokładne badanie efektów programu farmakologicznego i rehabilitacyjnego oraz jego personalizacji, z myślą o precyzyjnej medycynie zaprojektowanej, zdefiniowanej i zbudowanej na pacjencie.

Laboratorium Nanomedycyny i Biofotoniki Klinicznej (LABION) Fondazione Don Gnocchi od lat pracuje nad wykorzystaniem innowacyjnych metod, takich jak spektroskopia Ramana, do identyfikacji biomarkerów chorób neurodegeneracyjnych w łatwo dostępnych płynach biologicznych, takich jak krew i ślina. Spektroskopia ramanowska (RS) pozwala uzyskać specyficzną i pełną charakterystykę określonego płynu w szybki, czuły i nieniszczący sposób, bez szczególnych procedur przygotowania próbki do analizy. W RS całe widmo uzyskane z próbki jest wykorzystywane jako wysoce specyficzny „odcisk palca” dla wybranej próbki (np. śliny, krwi, surowicy, płynu mózgowo-rdzeniowego), który stanowi biomarker diagnostyczny. Analiza Ramana śliny wykazała już możliwość profilowania pacjentów z postępującymi patologiami z dużą dokładnością, aw szczególności rozróżniania pacjentów cierpiących na stwardnienie zanikowe boczne w porównaniu z pacjentami z innymi typami chorób neurodegeneracyjnych.

Jednocześnie LABION zweryfikował możliwość charakteryzowania za pomocą spektroskopii ramanowskiej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) krążących we krwi pacjentów z chP. Od 2017 roku LABION pracuje nad biochemicznym badaniem krążących EV w surowicy pacjentów z PD poprzez analizę EV w spektroskopii i wykazano zdolność RS do identyfikacji określonego profilu biochemicznego pęcherzyków krwi, który koreluje ze skalami klinicznymi. UPDRS III oraz Hoehn i Yahr. Analiza EV obecnych w ślinie pacjentów z PD może pomóc zrozumieć pochodzenie zmian biochemicznych w ślinie, a także zidentyfikować jeszcze bardziej specyficzne markery.

Spektroskopia Ramana jest zatem proponowana jako użyteczna metoda szybkiej i kompleksowej charakterystyki biochemicznej śliny i obecnego w niej składnika pęcherzykowego, bez stosowania procedur barwienia i znakowania.

Celem tego projektu jest walidacja specyficznej sygnatury ramanowskiej molekularnej dla różnych grup eksperymentalnych, co może doprowadzić do określenia biomarkera przydatnego w diagnostyce różnicowej osób z PD w porównaniu z osobami z atypowym parkinsonizmem, poprzez analizę płynu biologicznego, który nie jest inwazyjny, wypełniając w ten sposób obecny brak mierzalnego biomarkera do szybkiej diagnostyki różnicowej i monitorowania ewolucji chorób.

Szybka identyfikacja i diagnostyka różnicowa osób z chorobą Parkinsona i parkinsonizmami atypowymi pozwoli na szybkie ustalenie optymalnej terapii farmakologicznej i rehabilitacyjnej dla każdego pacjenta, prowadząc do znacznej poprawy jakości życia pacjenta, a w przyszłości zwiększonego prawdopodobieństwo spowolnienia postępu choroby.

POBIERANIE PRÓBEK: Pobieranie śliny od wszystkich wybranych osób zostanie przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta Salivette (SARSTEDT). Ślina zostanie pobrana od wszystkich badanych po odpowiednim czasie opóźnienia od karmienia i szczotkowania zębów. Parametry przedanalityczne (tj. temperatura przechowywania i czas między pobraniem a przetwarzaniem), nawyki żywieniowe i palenie będą odpowiednio rejestrowane. W skrócie, wymaz zostanie umieszczony w jamie ustnej i żuty przez 60 sekund w celu pobudzenia wydzielania śliny. Następnie wymaz będzie wirowany przez 2 minuty przy 1000 g w celu usunięcia fragmentów komórek i resztek jedzenia. Pobrane próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C.

PRZETWARZANIE PRÓBEK: Do analizy ramanowskiej kropla każdej próbki zostanie wylana na folię aluminiową w celu uzyskania powierzchniowego wzmocnionego rozpraszania ramanowskiego (SERS).

IZOLACJA EV: różne metody izolacji zostaną przetestowane pod kątem skutecznej izolacji EV. Oczyszczone EV zostaną następnie skoncentrowane i przeanalizowane za pomocą standardowych technik i spektroskopii ramanowskiej zgodnie z wcześniej zoptymalizowanym protokołem dla EV krwi. Ustawienia eksperymentalne zostaną dostosowane do EV śliny, z uwzględnieniem różnic w substracie, czasie akwizycji itp.

ZBIERANIE DANYCH: Widma śliny i EV będą zbierane przy użyciu mikroskopu Ramana Aramisa (Horiba Jobin-Yvon, Francja) wyposażonego w laserowe źródło światła pracujące przy 785 nm i 532 nm. Przyrząd będzie kalibrowany przed każdą analizą przy użyciu pasma odniesienia krzemu przy 520,7 cm-1. Widma ramanowskie będą pozyskiwane w zakresie od 400 do 1600 cm-1 dla śliny, 500-1800 i 2600-3200 cm-1 dla EV przy użyciu obiektywu 50x. Do akwizycji widm zostanie wykorzystany pakiet oprogramowania LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francja).

PRZETWARZANIE DANYCH: Wszystkie uzyskane widma zostaną skorygowane do linii bazowej i znormalizowane za pomocą wektora jednostkowego przy użyciu dedykowanego oprogramowania LabSpec 6. Udział substratu zostanie usunięty z każdego widma, jeśli to konieczne. Analiza statystyczna w celu walidacji metody zostanie przeprowadzona przy użyciu podejścia opartego na analizie wielowymiarowej. Analiza głównych składowych (PCA) zostanie przeprowadzona w celu zmniejszenia wymiarów danych i wykazania głównych trendów. Pierwsze 20 wynikowych składowych głównych (PC) zostanie wykorzystanych w modelu klasyfikacyjnym, liniowej analizie dyskryminacyjnej (LDA), w celu rozróżnienia danych maksymalizującego wariancję między wybranymi grupami. Zostanie wybrana najmniejsza liczba komputerów, aby zapobiec nadmiernemu dopasowaniu danych. Do oceny czułości metody, precyzji i dokładności modelu LDA zostanie wykorzystany test walidacji krzyżowej i matrycy pomyłek. Mann-Whitney zostanie przeprowadzony na wynikach PC w celu zweryfikowania statystycznie istotnych różnic między analizowanymi grupami. Analiza korelacji i korelacji cząstkowych zostanie przeprowadzona za pomocą testu Spearmana, przyjmując za ważną korelację tylko współczynniki o wartości p mniejszej niż 0,05. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Origin2018 (OriginLab, USA).

Krzywa ROC zostanie obliczona w celu oceny potencjału diagnostycznego metody.