Sliny a extracelulární vezikuly pro Parkinsonovu chorobu (RaSPiD)

Parkinsonova nemoc (PD) je neurodegenerativní porucha charakterizovaná motorickými symptomy, jako je bradykineze, třes, rigidita a posturální nestabilita. Přesný rehabilitační program navržený s ohledem na specifické vlastnosti pacienta umožňuje maximalizovat efekt farmakoterapie, zlepšit kvalitu života pacienta a zároveň omezit sekundární komplikace související s progresí onemocnění. V době diagnózy je však zvláště důležité umět rychle identifikovat jedince s idiopatickou Parkinsonovou nemocí a odlišit je od těch, kteří mají atypickou formu parkinsonismu, jako je progresivní supranukleární obrna (PSP), mnohočetná systémová atrofie (MSA) kortikobazální degenerace (CBD) a demence s Lewyho tělísky (DLB). Atypické parkinsonismy jsou ve skutečnosti progresivní onemocnění, která sdílejí některé známky a symptomy s PD, avšak tito pacienti nereagují tak účinně na medikamentózní terapii, protože buněčné a degenerativní mechanismy, které je charakterizují, jsou velmi odlišné. Z těchto důvodů je jejich včasná identifikace zvláště důležitá pro identifikaci nejlepší farmakologické a rehabilitační cesty pro každého pacienta.

Pro zajištění přesnějšího profilování pacienta, který zohledňuje individuální komplexní klinický obraz, by objev biomarkeru, který lze periodicky měřit ve snadno dostupné biotekutině, umožnil lepší stratifikaci pacienta, sledování průběhu onemocnění a pečlivé studium efekty farmakologického a rehabilitačního programu i jeho personalizace s ohledem na precizní medicínu navrženou, definovanou a postavenou na pacientovi.

Laboratoř nanomedicíny a klinické biofotoniky (LABION) Fondazione Don Gnocchi již léta pracuje na využití inovativních metod, jako je Ramanova spektroskopie, k identifikaci biomarkerů neurodegenerativních onemocnění ve snadno dostupných biologických tekutinách, jako je krev a sliny. Ramanova spektroskopie (RS) umožňuje získat specifickou a úplnou charakterizaci specifické tekutiny rychlým, citlivým a nedestruktivním způsobem, bez zvláštních postupů pro přípravu vzorku, který má být analyzován. U RS je celé spektrum získané ze vzorku použito jako vysoce specifický „otisk“ pro vybraný vzorek (např. sliny, krev, sérum, mozkomíšní mok), který představuje diagnostický biomarker. Ramanova analýza slin již prokázala možnost profilovat pacienty s progresivními patologiemi s dobrou přesností a konkrétně rozlišit subjekty trpící amyotrofickou laterální sklerózou ve srovnání s subjekty s jinými typy neurodegenerativních onemocnění.

Současně LABION ověřil možnost charakterizace pomocí Ramanovy spektroskopie, extracelulárních vezikul (EV) cirkulujících v krvi pacientů s PD. Od roku 2017 LABION pracuje na biochemické studii cirkulujících EV v séru pacientů s PD analýzou EV ve spektroskopii a byla prokázána schopnost RS identifikovat specifický biochemický profil krevních váčků, který koreluje s klinickými stupnicemi. UPDRS III a Hoehn a Yahr. Analýza EV přítomných ve slinách pacientů s PD by mohla pomoci porozumět původu biochemických změn ve slinách a také identifikovat ještě specifičtější markery.

Ramanova spektroskopie je proto navržena jako užitečná metoda pro rychlou a komplexní biochemickou charakterizaci slin a vezikulární složky v nich přítomné bez použití postupů barvení a značení.

Cílem tohoto projektu je ověření specifického Ramanova molekulárního podpisu pro různé experimentální skupiny, což může vést k určení biomarkeru užitečného pro diferenciální diagnostiku lidí s PD ve srovnání s jedinci s atypickým parkinsonismem pomocí analýzy biologická tekutina, která není invazivní, čímž vyplňuje současný nedostatek měřitelného biomarkeru pro rychlou diferenciální diagnostiku a pro sledování vývoje onemocnění.

Rychlá identifikace a diferenciální diagnostika pacientů s Parkinsonovou nemocí a atypickými parkinsonismy umožní rychle identifikovat optimální farmakologickou a rehabilitační terapii pro každého pacienta, což povede k výraznému zlepšení kvality života pacienta a v budoucnu ke zvýšení pravděpodobnost zpomalení progrese onemocnění.

ODBĚR VZORKŮ: Odběr slin od všech vybraných subjektů bude proveden podle pokynů výrobce salivette (SARSTEDT). Sliny budou získány od všech subjektů po přiměřené době od krmení a čištění zubů. Předanalytické parametry (tj. skladovací teplota a doba mezi sběrem a zpracováním), dietní a kuřácké návyky budou řádně zaznamenány. Stručně řečeno, tampon se vloží do úst a žvýká se po dobu 60 sekund, aby se stimulovalo slinění. Poté se tampon odstřeďuje po dobu 2 minut při 1000 g, aby se odstranily buněčné fragmenty a zbytky jídla. Odebrané vzorky budou skladovány při -80°C.

ZPRACOVÁNÍ VZORKU: Pro Ramanovu analýzu bude kapka každého vzorku odlita na hliníkovou fólii, aby se dosáhlo Ramanova rozptylu (SERS) s vylepšeným povrchem.

IZOLACE EV: Účinnou izolaci EV budou testovány různé metody izolace. Purifikované EV budou poté koncentrovány a analyzovány pomocí standardních technik a Ramanovou spektroskopií podle dříve optimalizovaného protokolu pro krevní EV. Experimentální nastavení se přizpůsobí slinným EV s ohledem na variace substrátu, dobu akvizice atd.

SBĚR DAT: Slinná a EV spektra budou získána pomocí mikroskopu Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francie) vybaveného laserovým světelným zdrojem pracujícím při 785 nm a 532 nm. Přístroj bude před každou analýzou kalibrován pomocí referenčního pásu křemíku při 520,7 cm-1. Ramanova spektra budou získána v oblasti mezi 400 a 1600 cm-1 pro sliny, 500-1800 a 2600-3200 cm-1 pro EV pomocí objektivu 50x. Pro pořízení spekter bude použit softwarový balík LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francie).

ZPRACOVÁNÍ DAT: Všechna získaná spektra budou korigována základní linií a normalizována jednotkovým vektorem pomocí specializovaného softwaru LabSpec 6. V případě potřeby bude příspěvek substrátu z každého spektra odstraněn. Statistická analýza pro ověření metody bude provedena pomocí přístupu vícerozměrné analýzy. Bude provedena analýza hlavních komponent (PCA), aby se snížily rozměry dat a prokázaly se hlavní trendy. Prvních 20 výsledných hlavních komponent (PC) bude použito v klasifikačním modelu, lineární diskriminační analýze (LDA), k rozlišení dat maximalizujícím rozptyl mezi vybranými skupinami. Bude vybrán nejmenší počet počítačů, aby se zabránilo přeplnění dat. K vyhodnocení citlivosti, preciznosti a správnosti modelu LDA bude použita křížová validace typu Leave-one-out a test matečné matice. Mann-Whitney bude proveden na skóre PC, aby se ověřily statisticky významné rozdíly mezi analyzovanými skupinami. Korelační a částečná korelační analýza bude provedena pomocí Spearmanova testu za předpokladu platné korelace pouze koeficientů s p-hodnotou nižší než 0,05. Statistická analýza bude provedena pomocí Origin2018 (OriginLab, USA).

Pro posouzení diagnostického potenciálu metody bude vypočítána ROC křivka.