Spytt og ekstracellulære vesikler for Parkinsons sykdom (RaSPiD)

Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ lidelse preget av motoriske symptomer som bradykinesi, tremor, stivhet og postural ustabilitet. Et nøyaktig rehabiliteringsprogram designet med tanke på de spesifikke egenskapene til pasienten lar deg maksimere effekten av medikamentell behandling, forbedre pasientens livskvalitet, samtidig som det begrenser sekundære komplikasjoner knyttet til sykdomsprogresjonen. På diagnosetidspunktet er det imidlertid spesielt viktig å raskt kunne identifisere individer med idiopatisk Parkinson og skille dem fra de som har en atypisk form for Parkinsonisme, slik som progressiv supranukleær parese (PSP), multippel systematrofi (MSA). , kortikobasal degenerasjon (CBD) og demens med Lewy-legemer (DLB). Atypiske parkinsonisme er faktisk progressive sykdommer som deler noen tegn og symptomer med PD, men disse pasientene reagerer ikke like effektivt på medikamentell behandling siden de cellulære og degenerative mekanismene som karakteriserer dem er svært forskjellige. Av disse grunner er tidlig identifisering spesielt viktig for å identifisere den beste farmakologiske og rehabiliterende veien for hver pasient.

For å sikre en mer nøyaktig pasientprofilering som tar hensyn til det individuelle komplekse kliniske bildet, vil oppdagelsen av en biomarkør som kan måles med jevne mellomrom i en lett tilgjengelig biovæske gi bedre pasientstratifisering, overvåking av sykdomsforløpet og nøye studie av effektene av det farmakologiske og rehabiliteringsprogrammet samt dets personalisering, med tanke på presisjonsmedisin utformet, definert og bygget på pasienten.

Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) av Fondazione Don Gnocchi har jobbet i årevis med å bruke innovative metoder som Raman-spektroskopi for å identifisere biomarkører for nevrodegenerative sykdommer i lett tilgjengelige biologiske væsker, som blod og spytt. Raman-spektroskopi (RS) gjør det mulig å oppnå en spesifikk og fullstendig karakterisering av en spesifikk væske på en rask, følsom og ikke-destruktiv måte, uten spesielle prosedyrer for forberedelse av prøven som skal analyseres. I RS brukes hele spekteret fra prøven som et svært spesifikt "fingeravtrykk" for den valgte prøven (f.eks. spytt, blod, serum, cerebrospinalvæske) som representerer den diagnostiske biomarkøren. Raman-analysen av spytt har allerede vist muligheten for å profilere pasienter med progressive patologier med god nøyaktighet og spesifikt å skille personer som lider av amyotrofisk lateral sklerose sammenlignet med personer med andre typer nevrodegenerative sykdommer.

Samtidig har LABION verifisert muligheten for å karakterisere ved Raman-spektroskopi, de ekstracellulære vesiklene (EV) som sirkulerer i blodet til pasienter med PD. Siden 2017 har LABION jobbet med den biokjemiske studien av sirkulerende EV-er i serumet til PD-pasienter ved å analysere EV-ene i spektroskopi, og evnen til RS til å identifisere en spesifikk biokjemisk profil av blodvesikler som korrelerer med kliniske skalaer har blitt demonstrert. UPDRS III og Hoehn og Yahr. Analysen av elbilene som er tilstede i spyttet til pasienter med PD kan bidra til å forstå opprinnelsen til biokjemiske endringer i spyttet, samt identifisere enda mer spesifikke markører.

Raman-spektroskopi er derfor foreslått som en nyttig metode for rask og omfattende biokjemisk karakterisering av spytt og den vesikulære komponenten som finnes i den, uten bruk av farging og merkingsprosedyrer.

Målet med dette prosjektet er validering av en spesifikk Raman molekylær signatur for de forskjellige eksperimentelle gruppene, som kan føre til bestemmelse av en biomarkør som er nyttig for differensialdiagnose av personer med PD sammenlignet med personer med atypisk Parkinsonisme, gjennom analyse av en biologisk væske som ikke er invasiv, og fyller dermed den nåværende mangelen på en målbar biomarkør for rask differensialdiagnose og for å overvåke utviklingen av sykdommene.

Den raske identifiseringen og differensialdiagnosen av personer med Parkinsons sykdom og atypiske parkinsonismer vil gjøre det mulig raskt å identifisere den optimale farmakologiske og rehabiliterende terapien for hvert individ, noe som fører til en betydelig forbedring av livskvaliteten for pasienten og, i fremtiden, en økt sannsynlighet for å bremse utviklingen av sykdommen.

PRØVEINNSAMLING: Spyttinnsamling fra alle de utvalgte forsøkspersonene vil bli utført etter Salivette (SARSTEDT)-produsentens instruksjoner. Spytt vil bli hentet fra alle forsøkspersoner etter en passende forsinkelsestid fra mating og tannpuss. Pre-analytiske parametere (dvs. lagringstemperatur og tid mellom innsamling og behandling), vil kostholds- og røykevaner bli registrert på riktig måte. Kort fortalt vil vattpinne bli plassert i munnen og tygget i 60 sekunder for å stimulere spyttutskillelsen. Deretter vil vattpinnen sentrifugeres i 2 minutter ved 1000 g for å fjerne cellefragmenter og matrester. Innsamlede prøver vil bli lagret ved -80°C.

PRØVEBEHANDLING: For Raman-analysen vil en dråpe av hver prøve støpes på en aluminiumsfolie for å oppnå Surface Enhanced Raman-spredning (SERS).

EV ISOLASJON: forskjellige isolasjonsmetoder vil bli testet for effektiv EV-isolasjon. Rensede EV-er vil deretter bli konsentrert og analysert ved hjelp av standardteknikker og ved Raman-spektroskopi etter en tidligere optimalisert protokoll for blod-EV-er. De eksperimentelle innstillingene vil bli tilpasset spytt-EV-ene, med tanke på variasjoner i underlag, innhentingstid osv.

DATAINNSAMLING: Spytt- og EV-spektra vil bli innhentet ved hjelp av et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utstyrt med en laserlyskilde som opererer ved 785 nm og 532 nm. Instrumentet vil bli kalibrert før hver analyse ved å bruke referansebåndet av silisium ved 520,7 cm-1. Raman-spektra vil bli innhentet i området mellom 400 og 1600 cm-1 for spytt, 500-1800 nad 2600-3200 cm-1 for elbiler ved bruk av et 50x objektiv. Programvarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) skal brukes til anskaffelse av spektra.

DATABEHANDLING: Alle de innhentede spektrene vil bli grunnlinjekorrigert og normalisert av enhetsvektor ved bruk av den dedikerte programvaren LabSpec 6. Bidraget fra substratet vil bli fjernet fra hvert spektre, om nødvendig. Den statistiske analysen for å validere metoden vil bli utført ved hjelp av en multivariat analysetilnærming. Principal Component Analysis (PCA) vil bli utført for å redusere datadimensjoner og bevise store trender. De første 20 resulterende hovedkomponentene (PC-er) vil bli brukt i en klassifiseringsmodell, Linear Discriminant Analysis (LDA), for å diskriminere dataene og maksimere variansen mellom de valgte gruppene. Det minste antallet PC-er vil bli valgt for å forhindre overtilpassing av data. Leave-one-out kryssvalidering og forvirringsmatrisetest vil bli brukt for å evaluere metodesensitiviteten, presisjonen og nøyaktigheten til LDA-modellen. Mann-Whitney vil bli utført på PC-score for å verifisere forskjellene statistisk relevante mellom de analyserte gruppene. Korrelasjons- og partiell korrelasjonsanalyse vil bli utført ved å bruke Spearmans test, forutsatt som gyldig korrelasjon kun koeffisientene med en p-verdi lavere enn 0,05. Den statistiske analysen vil bli utført ved bruk av Origin2018 (OriginLab, USA).

ROC-kurve vil bli beregnet for å vurdere det diagnostiske potensialet til metoden.