Saliva e vescicole extracellulari per la malattia di Parkinson (RaSPiD)

La malattia di Parkinson (MdP) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da sintomi motori come bradicinesia, tremore, rigidità e instabilità posturale. Un accurato programma riabilitativo studiato considerando le caratteristiche specifiche del paziente consente di massimizzare l'effetto della terapia farmacologica, migliorare la qualità di vita del paziente, limitando anche le complicanze secondarie legate alla progressione della malattia. Al momento della diagnosi, tuttavia, è particolarmente importante poter identificare rapidamente gli individui con Parkinson idiopatico e distinguerli da quelli che hanno una forma atipica di parkinsonismo, come la Paralisi Sopranucleare Progressiva (PSP), l'Atrofia Multisistemica (MSA) , degenerazione corticobasale (CBD) e demenza a corpi di Lewy (DLB). I parkinsonismi atipici sono infatti malattie progressive che condividono alcuni segni e sintomi con il PD, tuttavia questi pazienti non rispondono altrettanto efficacemente alla terapia farmacologica poiché i meccanismi cellulari e degenerativi che li caratterizzano sono molto diversi. Per questi motivi la loro precoce identificazione è particolarmente importante per individuare il miglior percorso farmacologico e riabilitativo per ogni paziente.

Per garantire una più accurata profilazione del paziente che tenga conto del complesso quadro clinico individuale, la scoperta di un biomarcatore misurabile periodicamente in un biofluido facilmente accessibile consentirebbe una migliore stratificazione del paziente, il monitoraggio del decorso della malattia e un attento studio della gli effetti del programma farmacologico e riabilitativo nonché la sua personalizzazione, in un'ottica di medicina di precisione pensata, definita e costruita sul paziente.

Il Laboratorio di Nanomedicina e Biofotonica Clinica (LABION) della Fondazione Don Gnocchi lavora da anni all'utilizzo di metodi innovativi come la spettroscopia Raman per identificare biomarcatori di malattie neurodegenerative in fluidi biologici facilmente accessibili, come sangue e saliva. La Spettroscopia Raman (RS) consente di ottenere una caratterizzazione specifica e completa di uno specifico fluido in modo rapido, sensibile e non distruttivo, senza particolari procedure per la preparazione del campione da analizzare. Nella RS l'intero spettro ottenuto dal campione viene utilizzato come "impronta digitale" altamente specifica per il campione selezionato (es. saliva, sangue, siero, liquido cerebrospinale) che rappresenta il biomarcatore diagnostico. L'analisi Raman della saliva ha già dimostrato la possibilità di profilare pazienti con patologie progressive con buona accuratezza e, nello specifico, di distinguere soggetti affetti da sclerosi laterale amiotrofica rispetto a soggetti con altri tipi di malattie neurodegenerative.

Allo stesso tempo, LABION ha verificato la possibilità di caratterizzare mediante spettroscopia Raman, le vescicole extracellulari (EV) circolanti nel sangue di pazienti con PD. Dal 2017, LABION lavora allo studio biochimico degli EV circolanti nel siero dei pazienti PD analizzando gli EV in spettroscopia ed è stata dimostrata la capacità di RS di identificare uno specifico profilo biochimico delle vescicole sanguigne che si correla con le scale cliniche. UPDRS III e Hoehn e Yahr. L'analisi degli EV presenti nella saliva dei pazienti con PD potrebbe aiutare a comprendere l'origine delle alterazioni biochimiche nella saliva oltre a identificare marcatori ancora più specifici.

La spettroscopia Raman si propone quindi come metodo utile per la caratterizzazione biochimica rapida e completa della saliva e della componente vescicolare presente al suo interno, senza l'utilizzo di procedure di colorazione e marcatura.

L'obiettivo di questo progetto è la validazione di una firma molecolare Raman specifica per i diversi gruppi sperimentali, che possa portare alla determinazione di un biomarcatore utile alla diagnosi differenziale delle persone con PD rispetto ai soggetti con Parkinsonismo atipico, attraverso l'analisi di un fluido biologico non invasivo, colmando così l'attuale mancanza di un biomarcatore misurabile per una rapida diagnosi differenziale e per monitorare l'evoluzione delle malattie.

La rapida identificazione e diagnosi differenziale dei soggetti con malattia di Parkinson e parkinsonismi atipici consentirà di individuare tempestivamente la terapia farmacologica e riabilitativa ottimale per ciascun soggetto, portando ad un significativo miglioramento della qualità della vita del paziente e, in futuro, ad un aumento probabilità di rallentare la progressione della malattia.

RACCOLTA DEL CAMPIONE: La raccolta della saliva da tutti i soggetti selezionati verrà eseguita seguendo le istruzioni del produttore di Salivette (SARSTEDT). La saliva sarà ottenuta da tutti i soggetti dopo un adeguato lasso di tempo dall'alimentazione e dallo spazzolamento dei denti. Parametri pre-analitici (es. la temperatura di conservazione e il tempo che intercorre tra la raccolta e la lavorazione), l'alimentazione e l'abitudine al fumo saranno opportunamente registrate. In breve, il tampone verrà posto in bocca e masticato per 60 secondi per stimolare la salivazione. Quindi il tampone verrà centrifugato per 2 minuti a 1.000 g per rimuovere frammenti cellulari e residui di cibo. I campioni raccolti saranno conservati a -80° C.

PROCESSAZIONE DEL CAMPIONE: Per l'analisi Raman, una goccia di ciascun campione verrà colata su un foglio di alluminio per ottenere il Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).

ISOLAMENTO EV: diversi metodi di isolamento saranno testati per un efficace isolamento EV. Gli EV purificati saranno quindi concentrati e analizzati mediante tecniche standard e mediante spettroscopia Raman seguendo un protocollo precedentemente ottimizzato per gli EV nel sangue. Le impostazioni sperimentali saranno adattate agli EV salivari, considerando le variazioni nel substrato, il tempo di acquisizione, ecc.

RACCOLTA DATI: Gli spettri salivari ed EV saranno acquisiti utilizzando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) dotato di una sorgente di luce laser operante a 785 nm e 532 nm. Lo strumento verrà calibrato prima di ogni analisi utilizzando la banda di riferimento del silicio a 520,7 cm-1. Gli spettri Raman saranno acquisiti nella regione tra 400 e 1600 cm-1 per la saliva, 500-1800 e 2600-3200 cm-1 per EV utilizzando un obiettivo 50x. Per l'acquisizione degli spettri verrà utilizzato il pacchetto software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon, Francia).

ELABORAZIONE DEI DATI: Tutti gli spettri acquisiti saranno corretti al basale e normalizzati per vettore unitario utilizzando il software dedicato LabSpec 6. Il contributo del substrato sarà rimosso da ogni spettro, se necessario. L'analisi statistica per validare il metodo sarà eseguita utilizzando un approccio di analisi multivariata. Verrà eseguita l'analisi delle componenti principali (PCA) per ridurre le dimensioni dei dati e per evidenziare le principali tendenze. I primi 20 Componenti Principali (PC) risultanti saranno utilizzati in un modello di classificazione, Linear Discriminant Analysis (LDA), per discriminare i dati massimizzando la varianza tra i gruppi selezionati. Verrà selezionato il minor numero di PC per evitare l'overfitting dei dati. La validazione incrociata leave-one-out e il test della matrice di confusione saranno utilizzati per valutare la sensibilità, la precisione e l'accuratezza del metodo del modello LDA. Mann-Whitney verrà eseguito sui punteggi dei PC per verificare le differenze statisticamente rilevanti tra i gruppi analizzati. L'analisi di correlazione e di correlazione parziale sarà effettuata utilizzando il test di Spearman, assumendo come correlazione valida solo i coefficienti con p-value inferiore a 0.05. L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando Origin2018 (OriginLab, USA).

La curva ROC sarà calcolata per valutare il potenziale diagnostico del metodo.