RPLの女性におけるniPGT-Aの無作為化二重盲検対照試験 (niPGTA)

試験の目的と目的 この無作為化二重盲検対照試験の主な目的は、最初の凍結胚移植を受ける RPL の女性において、形態のみに基づく胚選択と形態および niPGT-A に基づく胚選択の有効性を比較することです。 二次的な目的は、eNK 細胞が流産率および生児出生率に与える影響と、スフェロイド/BAP-EB 付着アッセイを使用した生児出生の予測を評価することです。

テストする主な仮説:

1. 形態と異数性の niPGT-A に基づく胚選択は、形態のみに基づく対照群と比較して、RPL の女性の体外受精の生児出生率を高めます。
2. 形態と異数性の niPGT-A に基づく胚選択は、形態のみに基づく対照群と比較して、RPL の女性の IVF 後の流産率を低下させます。

2. 試験デザイン これは無作為二重盲検対照試験です。 適格な女性が研究のために募集され、カウンセリング後に書面によるインフォームドコンセントが得られます。

子宮内膜の評価 すべての女性は、体外受精の月の前の黄体形成ホルモンサージ（LH + 7）の7日後に、ピペルサンプラーを使用して子宮内膜生検を受けます。 子宮内膜サンプルの一部は、CD56抗体による子宮内膜uNK細胞の免疫組織化学染色のためにパラホルムアルデヒドで固定されます[26,27]。 子宮内膜サンプルの他の部分は、スフェロイド/BAP-EB付着アッセイ[28]の上皮細胞および間質細胞の分離に使用され、実験室での胚付着率を予測します。 倫理的な問題と実際的な問題により、子宮内膜の評価にヒト胚を使用することは現実的ではありません。 BAP-EB モデル [28] は、この研究で胚 (胚盤胞) 代理として使用されます。 BAP-EB スフェロイド モデルは、ヒト胚性幹細胞から分化しています。 分化の７２時間後のＢＡＰ－ＥＢ（ＢＡＰ－ＥＢ－７２ｈ）は、胚盤胞の７日目の栄養外胚葉細胞の分子特徴を有する［２８］。 この研究では、BAP-EB は初代子宮内膜上皮細胞と共培養され、確立されたプロトコルに従って付着率が決定されます。

IVFプロトコル 女性は、示されているように、細胞質内精子注入法（ICSI）の有無にかかわらずIVFを受けます。 女性は、プロゲスチン プライミング プロトコル [29] またはアンタゴニスト プロトコルを使用して卵巣刺激を受けます。 超音波スキャンは、胞状卵胞の数を数え、卵巣嚢胞の存在を除外するために、月経の2〜3日目に配置されます。 血清エストラジオールおよびプロゲステロン濃度がチェックされ、それらが基礎値である場合、性腺刺激ホルモン注射による卵巣刺激（胞状卵胞数に応じて毎日225〜300 IU）が10〜12日間与えられます。 Provera 10 mg は、プロゲスチン プライミング プロトコルで 2 ～ 3 日目からトリガー日まで毎日与えられ、時期尚早の LH サージを防ぎますが、GnRH アンタゴニストは卵巣刺激の 6 日目からトリガー日まで開始されます。 卵胞の成長を監視するために、定期的な超音波モニタリングが行われます。 ゴナドトロピン投与量の調整は、卵胞の数とサイズに対応しています。 3 つの卵胞の直径が 17 mm を超えると、GnRH アゴニスト (デカペプチル 0.3 mg) またはヒト絨毛性ゴナドトロピン (オビドレル 0.25 mg) が投与されます。 卵母細胞の回収は、経膣超音波ガイド下で HCG またはアゴニスト トリガーの 34 ～ 36 時間後に予定されます。

正常な受精は、授精後 16 ～ 18 時間で 2 つの前核の存在によって評価および確認されます。 すべての卵割段階の胚は、通常、卵母細胞の回収後 5 日目または 6 日目に、単相培地で胚盤胞段階まで個別に成長します。 3 日目に培養液を補充し、37℃、6% CO2、低酸素圧 (5%) で培養を続けます。 刺激されたサイクルでは、胚盤胞の新鮮な移植は行われません。

形態による胚盤胞の等級分け

胚盤胞は、Gardner の分類に従って分類されます (29)。 胚盤胞の等級付けシステムは、以下に基づいて、各胚盤胞胚に 3 つの個別の品質スコアを割り当てます。

1. 胚盤胞の発生段階：拡大と孵化の状態
2. 内部細胞質量スコア
3. 栄養外胚葉スコア

拡張グレード 胚盤胞の発生と段階の状態

1. 胚盤腔は胚の体積の半分未満
2. 胚盤腔は胚の体積の半分以上
3. 完全な胚盤胞、空洞​​が胚を完全に満たしている
4. 拡大した胚盤胞、胚よりも大きな腔、透明帯の菲薄化
5. 透明帯からの孵化
6. 透明帯から孵化

内部細胞塊のグレード 内部細胞塊の品質 A 多くの細胞がぎっしりと詰まっている B いくつかの細胞がゆるくグループ化されている C 非常に少ない細胞

栄養外胚葉グレード 栄養外胚葉の品質 A 細胞が多く、接着層を形成している B 細胞が少なく、緩い上皮を形成している C 大きな細胞がほとんどない

胚盤胞は、拡大スコア 3 以上の発生段階で凍結保存されます。 胚盤胞が 5 日目に拡張段階 3 に達しない場合は、6 日目に凍結保存に適しているかどうかが評価されます。 内部細胞量または栄養外胚葉のスコアが B 以上の胚盤胞は、利用可能な胚盤胞と見なされます。

各胚盤胞は個別にガラス化によって凍結され、その SCM (約 8 μl) は個別に個別に -80℃ で凍結されます。 発生学者は、ガードナーの基準による最良の形態に基づいて、一連の胚盤胞移植を準備します。

次に、胚盤胞凍結の日に、PGT 検査室の検査室スタッフによるランダム化プログラムを使用して、女性を 1:1 の比率で 2 つのグループにランダムに割り当てます。

1. 形態学とniPGT-Aを使用した介入群と
2. 形態のみに基づく対照群。

女性と臨床医は、割り当てられた治療グループを知らされません。 PGT 検査室の検査室スタッフのみが、グループの割り当てを認識します。

使用済み培養培地 (SCM) の niPGT-A 介入グループでは、すべての SCM サンプルで会社の推奨に従って、NGS を使用した包括的な染色体スクリーニングが実行されます。 対照群では、測定は、最初の移植で交換された胚盤胞の SCM サンプルで遡及的に行われます。 すべての SCM サンプルは、将来の研究のために保存されます。

市販の NI-PGT キット (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT キット、PerkinElmer) を使用して、SCM サンプルを分析します。 プロトコルは、世界中の 15 の研究所からの非侵襲的なサンプルで以前に最適化されています。 このキットは、シングル チューブ ワークフローの 2 ステップ PCR に従って、SCM で DNA を全ゲノム増幅し、テンプレート DNA にインデックスと配列固有のアダプターを付加して、すぐにシーケンス可能なサンプルを生成します。

精製後、各サンプルの濃度を等モルに調整し、プール (96 サンプル) してから、MiSeq システム (Illumina) で 1x75 bp 読み取り長で配列決定します。 オンボードの二次解析は、MiSeq Reporter (Illumina)、続いて PG-Find Software (v 1.0、PerkinElmer) によって自動的に実行されました。 異常な、構造化されていない、反復性の高い配列に一致する読み取りは、分析から除外されます。 1,000 kb のターゲット ビン サイズが使用され、10 Mb の最小解像度が得られます。 すべてのゲノム位置は、ヒトゲノムビルド NCBI 37 を参照しています。

PG-Find ソフトウェアの初期設定では、異数性の分類は CNV (コピー数変動) 値によって決定されます。 CNV 値 >2.7 はゲインと見なされ、CNV 値 <1.3 は損失と見なされます。 染色体の 1 つまたは複数に増加/損失が見られる場合、サンプルは非正倍数体であると結論付けられます。

SCM サンプルの niPGT-A レポートは、正倍数性、非正倍数性、および非有益性である可能性があります。 胚移植の順序を優先するためにのみ使用されます。 niPGT-A レポートで非 euploid 結果を持つ胚盤胞は破棄されません。

盲検化 発生学者は、上記のガードナーの基準に従って胚盤胞の形態を等級付けし、IT 技術者が管理するオンライン データベースに胚盤胞の等級付けを入力します。 PGT 検査室の検査室スタッフは、NIPGT の結果が利用可能になると、PGT の結果をローカル データベースに入力します。 IT 技術者は PGT ラボからデータベースを収集し、オンライン ソフトウェアに入力して、胚盤胞の発生日 (6 日目よりも 5 日目) に依存する所定のアルゴリズムに従って胚移植のシーケンスをコンパイルします。形態と niPGT-A の結果。 IT 技術者は、胚盤胞のグレーディングに関する情報と NIPGT の結果を含まない一連の胚移植を、IVF 検査室の発生学者に発行します。 したがって、募集された被験者、臨床医、発生学者は、グループの割り当てを知らされません。

niPGT-A の予備結果 進行中の NIPGT-A 試験の予備結果には、1168 SCM が含まれていました。 並行して培養されたが胚とは接触していない培地をコントロールとして収集しました（n = 238）。 増幅は 1158 SCM (99.1%、1158/1168) で成功し、1141 SCM で最終的な結果 (97.6%、1141/1168) が得られました。 すべてのコントロールは増幅を示しませんでした。

凍結胚移植 (FET) 胚盤胞は、女性が定期的な月経周期を持っているかどうかに応じて、その後の自然、レトロゾール、またはホルモン補充周期で交換できます。 毎回 1 つの胚盤胞のみが移植されます。 対照群では、最良の形態の胚盤胞が最初に交換され、無作為化の前に胚盤胞移植の順序が決定されます。 介入グループでは、niPGT-A レポートが利用可能になった後に胚盤胞移植の順序が変更されるため、最良の形態と正倍数体の結果を持つ胚盤胞が最初に置き換えられます。

妊娠 移植後 14 日目に尿妊娠検査を行います。 妊娠検査が陽性の場合は、経膣超音波検査を 2 週間後に実施して、妊娠の位置を特定し、胎児の生存率と胎児の数を確認します。 その後の管理は、他の妊娠初期の女性と同じです。 進行中の妊娠が 8 ～ 10 週になると、産前ケアに紹介されます。

フォローアップ 妊娠および出産データの取得に関する書面による同意は、不妊症のために体外受精を受けるすべての患者と同様に、研究時に女性から求められます。 女性は出産後に電話で連絡を受け、体外受精妊娠後のルーチンとして妊娠結果の情報を取得します。 妊娠の結果（分娩、流産）、生まれた赤ちゃんの数、出生時体重、産科合併症が記録されます。

最初の FET で妊娠に失敗した女性は、盲検が解除され、可能であれば正倍数体胚が交換されます。 正倍体胚がない場合、女性は 2 回目の IVF サイクルを受けることを選択できます。