Randomizovaná dvojitě slepá kontrolovaná studie niPGT-A u žen s RPL (niPGTA)

Cíle a účel studie Primárním cílem této randomizované dvojitě zaslepené kontrolované studie je porovnat účinnost při selekci embryí na základě samotné morfologie oproti morfologii a niPGT-A u žen s RPL podstupujících první transfer zmrazeného embrya. Sekundárními cíli je vyhodnotit vliv eNK buněk na potratovost a míru porodnosti a predikci živě narozených dětí pomocí testu připojení sféroidů/BAP-EB.

Hlavní hypotézy k testování:

1. Selekce embryí na základě morfologie a niPGT-A pro aneuploidii vede k vyšší míře živé porodnosti IVF u žen s RPL ve srovnání s kontrolní skupinou založenou pouze na morfologii.
2. Selekce embryí na základě morfologie a niPGT-A pro aneuploidii vede k nižší míře potratů po IVF u žen s RPL ve srovnání s kontrolní skupinou založenou pouze na morfologii.

2. Uspořádání studie Toto je randomizovaná dvojitě slepá kontrolovaná studie. Do studie budou přijaty způsobilé ženy a po konzultaci bude získán informovaný písemný souhlas.

Vyšetření endometria U všech žen bude provedena biopsie endometria za použití vzorkovače Pipelle 7 dní po prudkém nárůstu luteinizačního hormonu (LH+7) před měsícem podstoupení IVF. Část vzorků endometria bude fixována v paraformaldehydu pro imunohistochemické barvení endometriálních uNK buněk protilátkou CD56 [26,27]. Druhá část vzorků endometria bude použita pro izolaci epiteliálních a stromálních buněk pro test přichycení sféroidů/BAP-EB [28] k predikci míry přichycení embrya v laboratorním prostředí. Vzhledem k etickým otázkám a praktickým potížím není použití lidských embryí pro hodnocení endometria proveditelné. Model BAP-EB [28] bude v této studii použit jako náhradní embryo (blastocysta). BAP-EB sféroidní model se liší od lidských embryonálních kmenových buněk. BAP-EB po 72 hodinách diferenciace (BAP-EB-72h) mají molekulární podpis trofektodermálních buněk blastocyst 7. dne [28]. V této studii bude BAP-EB kokultivován s primárními endometriálními epiteliálními buňkami a rychlost připojení bude stanovena podle našeho zavedeného protokolu.

IVF protokol Ženy podstoupí IVF s nebo bez intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI), jak je uvedeno. Ženy dostanou ovariální stimulaci pomocí progestinového primárního protokolu [29] nebo antagonistického protokolu. Ultrazvukové vyšetření bude uspořádáno na 2.–3. den menstruace pro zjištění počtu antrálních folikulů a pro vyloučení přítomnosti ovariální cysty. Bude zkontrolována koncentrace estradiolu a progesteronu v séru a pokud jsou bazální, provede se stimulace vaječníků injekcemi gonadotropinu (225-300 IU denně v závislosti na počtu antrálních folikulů) po dobu 10-12 dnů. Provera 10 mg denně se bude podávat ode dne 2-3 do dne spuštění v protokolu aktivovaném progestinem, aby se zabránilo předčasnému nárůstu LH, zatímco antagonista GnRH bude zahájen v den 6 ovariální stimulace do dne spuštění. Pro sledování růstu folikulů bude prováděno pravidelné ultrazvukové monitorování. Úprava dávkování gonadotropinu odpovídá počtu a velikosti folikulů. Když tři folikuly dosáhnou průměru >17 mm, bude podán agonista GnRH (Decapeptyl 0,3 mg) nebo lidský choriový gonadotropin (Ovidrel 0,25 mg). Odběr oocytů bude naplánován 34–36 hodin po spuštění HCG nebo agonisty pod transvaginálním ultrazvukovým vedením.

Normální oplodnění bude hodnoceno a potvrzeno přítomností dvou pronukleů 16-18 hodin po inseminaci. Všechna embrya ve stádiu štěpení budou pěstována jednotlivě do stádia blastocysty, obvykle 5. nebo 6. den po získání oocytů, v monofázovém médiu. 3. den bude kultivační médium doplněno a kultivace bude pokračovat při 37 °C a 6 % CO2 při sníženém tlaku kyslíku (5 %). Ve stimulovaném cyklu nebude proveden žádný čerstvý přenos blastocyst.

Klasifikace blastocysty podle morfologie

Blastocysty jsou klasifikovány podle Gardnerovy klasifikace (29). Systém klasifikace blastocyst přiděluje každému embryu blastocysty 3 samostatná skóre kvality na základě následujících údajů:

1. Fáze vývoje blastocysty: stav expanze a líhnutí
2. Skóre vnitřní buněčné hmoty
3. Trophectoderm skóre

Stupeň expanze Vývoj blastocysty a stav stádia

1. Blastocoel dutina menší než polovina objemu embrya
2. Blastocoel dutina více než polovina objemu embrya
3. Plná blastocysta, dutina zcela vyplňující embryo
4. Rozšířená blastocysta, dutina větší než embryo, se ztenčením zona pellucida
5. Vylíhnutí ze zona pellucida
6. Vylíhla se ze zona pellucida

Třída vnitřní buněčné hmoty Kvalita vnitřní buněčné hmoty A Mnoho buněk, těsně zabalených B Několik buněk, volně seskupené C Velmi málo buněk

Třída trofektodermu Kvalita trofektodermu A Mnoho buněk tvořících soudržnou vrstvu B Málo buněk tvořící volný epitel C Velmi málo velkých buněk

Blastocysty jsou kryokonzervovány ve vývojové fázi se skóre expanze 3 nebo vyšším. Pokud blastocysta nedosáhne 5. dne expanze 3. stupně, posoudí se 6. den, zda je vhodná pro kryokonzervaci. Blastocysty buď s vnitřní buněčnou hmotou nebo trofektodermem označené jako B nebo výše, jsou považovány za využitelné blastocysty.

Každá blastocysta bude zmražena vitrifikací jednotlivě a její SCM (~8 µl) bude zmražena při -800C samostatně a jednotlivě. Embryolog připraví sekvenci přenosu blastocysty na základě nejlepší morfologie podle Gardnerových kritérií.

Poté, v den zmrazení blastocysty, budou ženy náhodně rozděleny do dvou skupin v poměru 1:1 pomocí randomizačního programu pracovníků laboratoře v PGT laboratoři.

1. intervenční skupina využívající morfologii a niPGT-A a
2. kontrolní skupina pouze na základě morfologie.

Ženy a lékaři budou zaslepeni vůči léčebným skupinám, kterým jsou přiděleni. Pouze laboratorní pracovníci v laboratoři PGT budou vědět o skupinovém zadání.

niPGT-A spotřebovaného kultivačního média (SCM) V intervenční skupině bude proveden komplexní chromozomový screening pomocí NGS dle doporučení společnosti u všech vzorků SCM. V kontrolní skupině bude měření provedeno retrospektivně u těch vzorků SCM blastocyst, které jsou nahrazeny při prvním přenosu. Všechny vzorky SCM budou uloženy pro případný budoucí výzkum.

K analýze vzorků SCM bude použita komerčně dostupná souprava NI-PGT (souprava PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT kit, PerkinElmer). Protokol byl již dříve optimalizován pomocí neinvazivních vzorků z 15 laboratoří po celém světě. Souprava se řídí pracovním postupem jedné zkumavky, dvoukrokovou PCR pro amplifikaci DNA v SCM celého genomu a poté připojuje indexy a sekvenčně specifické adaptéry k templátové DNA, což vede k sekvenování hotových vzorků.

Po purifikaci je koncentrace každého vzorku upravena na ekvimolární, spojena (96 vzorků) a poté sekvenována na systému MiSeq (Illumina) při délce čtení 1x75 bp. Sekundární analýza na palubě byla provedena automaticky pomocí MiSeq Reporter (Illumina) následovaného PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Čtení přiřazující se k anomálním, nestrukturovaným a vysoce repetitivním sekvencím jsou z analýzy filtrována. Je použita cílová velikost bin 1 000 kb, což dává minimální rozlišení 10 Mb. Všechny genomové pozice odkazují na sestavení lidského genomu NCBI 37.

Podle výchozího nastavení softwaru PG-Find je klasifikace aneuploidie určena hodnotou CNV (copy umber variation). Hodnota CNV >2,7 je považována za zisk, zatímco hodnota CNV <1,3 je považována za ztrátu. Vzorek bude považován za neeuploidní, když jeden nebo více chromozomů vykazuje zisk/ztrátu.

Zpráva niPGT-A vzorku SCM může být euploidní, neeuploidní a neinformativní. Používá se pouze k upřednostnění sekvence přenosu embryí. Blastocysty s neeuploidním výsledkem ve zprávě niPGT-A nebudou vyřazeny.

Zaslepení Embryolog ohodnotí morfologii blastocyst podle Gardnerových kritérií uvedených výše a zadá klasifikaci blastocyst do online databáze, kterou bude spravovat IT technik. Pracovníci laboratoře v laboratoři PGT vloží výsledek PGT do místní databáze, jakmile budou k dispozici výsledky NIPGT. IT technik shromáždí databázi z laboratoře PGT a zadá ji do online softwaru pro sestavení sekvence přenosu embryí podle předem stanoveného algoritmu, který závisí na dni vývoje blastocysty (den 5 lepší než den 6), blastocysty morfologie a výsledek niPGT-A. IT technik vydá embryologům v IVF laboratoři sekvenci embryotransferu, která neobsahuje informace o gradingu blastocysty a výsledku NIPGT. Proto budou rekrutovaní jedinci, kliničtí lékaři a embryologové zaslepeni vůči rozdělení do skupin.

Naše předběžné výsledky niPGT-A Předběžné výsledky probíhající studie NIPGT-A zahrnovaly 1168 SCM. Média kultivovaná paralelně, ale bez kontaktu s embryi, byla odebrána jako kontrola (n=238). Amplifikace byla úspěšná u 1158 SCM (99,1 %, 1158/1168) a 1141 SCM vedla k průkaznému výsledku (97,6 %, 1141/1168). Všechny kontroly nevykazovaly žádnou amplifikaci.

Zmrazený embryotransfer (FET) Blastocysty mohou být nahrazeny v následných přirozených, letrozolových nebo hormonálních substitučních cyklech, v závislosti na tom, zda ženy mají pravidelné menstruační cykly nebo ne. Pokaždé bude přenesena pouze jedna blastocysta. V kontrolní skupině budou nejdříve nahrazeny blastocysty s nejkvalitnější morfologií a sekvence přenosu blastocyst je rozhodnuta před randomizací. V intervenční skupině budou nejprve nahrazeny blastocysty s nejlepší morfologií a euploidním výsledkem, protože sekvence přenosu blastocyst bude upravena poté, co budou k dispozici zprávy niPGT-A.

Těhotenství Těhotenský test z moči bude proveden 14 dní po transferu. Pokud je těhotenský test pozitivní, provede se o dva týdny později transvaginální ultrazvuk k lokalizaci těhotenství a potvrzení životaschopnosti plodu a počtu plodů. Následný management bude stejný jako u ostatních žen s časným těhotenstvím. Budou odesláni do prenatální péče, když probíhající těhotenství trvá 8-10 týdnů.

Sledování Písemný souhlas týkající se získání údajů o těhotenství a porodu bude požadován od žen v době studie, stejně jako u všech pacientek přicházejících na IVF kvůli neplodnosti. Ženy budou po porodu telefonicky kontaktovány, aby získaly informace o výsledcích těhotenství jako rutinu po těhotenství IVF. Bude zaznamenáván výsledek těhotenství (porod, potrat), počet narozených dětí, porodní váha a porodnické komplikace.

Ženy, kterým se nepodaří otěhotnět v prvním FET, budou odslepeny a euploidní embryo bude nahrazeno, pokud bude k dispozici. Bez euploidního embrya se ženy mohou rozhodnout podstoupit druhý cyklus IVF.