NiPGT-A 在 RPL 女性中的随机双盲对照试验 (niPGTA)

试验目的和目的 这项随机双盲对照试验的主要目的是比较单独基于形态学与形态学和 niPGT-A 的胚胎选择在接受第一次冷冻胚胎移植的 RPL 女性中的疗效。 次要目标是评估 eNK 细胞对流产率和活产率的影响，以及使用球体/BAP-EB 附着测定法预测活产率。

待检验的主要假设：

1. 与仅基于形态学的对照组相比，基于形态学和 niPGT-A 的非整倍体胚胎选择导致 RPL 女性的 IVF 活产率更高。
2. 与仅基于形态学的对照组相比，基于形态学和 niPGT-A 的非整倍体胚胎选择导致 RPL 女性 IVF 后的流产率较低。

2. 试验设计 这是一项随机双盲对照试验。 将招募符合条件的女性参加研究，并在咨询后获得书面知情同意书。

子宫内膜评估 在进行 IVF 的月份之前，在促黄体激素激增 (LH+7) 后 7 天，所有女性都将使用 Pipelle 采样器进行子宫内膜活检。 将部分子宫内膜样本固定在多聚甲醛中，用 CD56 抗体对子宫内膜 uNK 细胞进行免疫组化染色 [26,27]。 子宫内膜样本的另一部分将用于球体/BAP-EB 附着试验的上皮细胞和基质细胞分离 [28]，以预测实验室环境中的胚胎附着率。 由于伦理问题和实际困难，使用人类胚胎进行子宫内膜评估是不可行的。 BAP-EB模型[28]将用作本研究中的胚胎（囊胚）替代物。 BAP-EB 球体模型是从人类胚胎干细胞中分化出来的。 分化 72 小时后的 BAP-EB (BAP-EB-72h) 具有囊胚第 7 天滋养外胚层细胞的分子特征 [28]。 在这项研究中，BAP-EB 将与原代子宫内膜上皮细胞共培养，并根据我们既定的方案确定附着率。

IVF 方案 女性将按照指示接受或不进行胞浆内单精子注射 (ICSI) 的 IVF。 这些女性将使用孕激素预启动方案 [29] 或拮抗剂方案接受卵巢刺激。 超声扫描将安排在月经的第 2-3 天进行，以检查窦状卵泡计数并排除卵巢囊肿的存在。 将检查血清雌二醇和孕酮浓度，如果它们是基础浓度，则给予促性腺激素注射（每天 225-300 IU，取决于窦卵泡计数）刺激卵巢 10-12 天。 Provera 每天 10 毫克将从第 2-3 天到触发日在孕激素启动方案中给予，以防止过早的 LH 激增，而 GnRH 拮抗剂将在卵巢刺激的第 6 天到触发日开始。 定期进行超声波监测以监测卵泡的生长情况。 促性腺激素剂量的调整与卵泡的数量和大小相对应。 当三个卵泡直径达到>17mm时，将给予GnRH激动剂（Decapeptyl 0.3mg）或人绒毛膜促性腺激素（Ovidrel 0.25mg）。 在经阴道超声引导下，HCG 或激动剂触发后 34-36 小时将安排取卵。

正常受精将通过在授精后 16-18 小时出现两个原核来评估和确认。 所有卵裂期胚胎将在单相培养基中单独生长至胚泡期，通常是取卵后第 5 天或第 6 天。 第 3 天，将补充培养基，并在 37oC 和 6% CO2 的低氧张力 (5%) 下继续培养。 在刺激周期中不会进行囊胚的新鲜移植。

胚泡的形态分级

囊胚根据 Gardner 分类法进行分级 (29)。 囊胚分级系统根据以下内容为每个囊胚胚胎分配 3 个单独的质量分数：

1. 囊胚发育阶段：膨胀和孵化状态
2. 内细胞质量分数
3. 滋养外胚层评分

扩展级囊胚发育和阶段状态

1. 囊胚腔小于胚胎体积的一半
2. 囊胚腔超过胚胎体积的一半
3. 完整囊胚，腔完全充满胚胎
4. 膨胀的囊胚，空腔比胚胎大，透明带变薄
5. 从透明带孵化
6. 从透明带中孵化出来

内细胞团等级 内细胞团质量 A 许多细胞，紧密排列 B 几个细胞，松散排列 C 极少细胞

滋养外胚层等级 滋养外胚层质量 A 许多细胞，形成粘附层 B 很少细胞，形成疏松的上皮 C 非常少的大细胞

囊胚在发育阶段冷冻保存，扩增分数为 3 或以上。 如果胚泡在第 5 天没有达到第 3 阶段的扩增，将在第 6 天评估它是否适合冷冻保存。 内细胞团或滋养外胚层评分为 B 或以上的囊胚被认为是可利用的囊胚。

每个胚泡将通过玻璃化冷冻单独冷冻，其 SCM（~8 微升）将分别单独冷冻在 -800C 下。 胚胎学家将根据加德纳标准的最佳形态准备一系列囊胚移植。

然后，在囊胚冷冻当天，PGT 实验室的实验室工作人员将使用随机化程序将女性以 1:1 的比例随机分配到两组。

1. 干预组使用形态学和 niPGT-A 和
2. 对照组仅基于形态学。

妇女和临床医生将不知道他们被分配到的治疗组。 只有 PGT 实验室的实验室工作人员会知道小组分配。

废培养基 (SCM) 的 niPGT-A 在干预组中，将根据公司的建议对所有 SCM 样本进行使用 NGS 的全面染色体筛查。 在对照组中，将对在第一次转移中更换的囊胚的 SCM 样本进行回顾性测量。 所有 SCM 样本都将被保存以供将来可能的研究使用。

市售的 NI-PGT 试剂盒（PG-Seq 快速非侵入性 PGT 试剂盒，PerkinElmer）将用于分析 SCM 样品。 该协议先前已使用来自全球 15 个实验室的非侵入性样本进行了优化。 该试剂盒遵循单管工作流程，对全基因组进行两步 PCR，在 SCM 中扩增 DNA，然后将索引和序列特异性接头附加到模板 DNA，从而产生可用于测序的样品。

纯化后，将每个样品的浓度调整为等摩尔浓度，合并（96 个样品），然后在 MiSeq 系统（Illumina）上以 1x75 bp 读取长度进行测序。 机载二次分析由 MiSeq Reporter (Illumina) 随后由 PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer) 自动执行。 从分析中过滤掉与异常、非结构化和高度重复序列对齐的读取。 使用 1,000 kb 的目标 bin 大小，给出 10Mb 的最小分辨率。 所有基因组位置均参考人类基因组构建 NCBI 37。

根据PG-Find软件的默认设置，非整倍体的分类是由CNV（copy umber variation）值决定的。 CNV值>2.7被认为是收益，CNV值<1.3被认为是损失。 当一个或多个染色体显示增益/丢失时，样本将被断定为非整倍体。

SCM 样本的 niPGT-A 报告可以是整倍体、非整倍体和非信息性报告。 它仅用于确定胚胎移植顺序的优先顺序。 在 niPGT-A 报告中具有非整倍体结果的囊胚将不会被丢弃。

设盲 胚胎学家将根据上述加德纳标准对胚泡的形态进行分级，并将胚泡的分级输入在线数据库，该数据库将由 IT 技术人员管理。 当 NIPGT 结果可用时，PGT 实验室的实验室工作人员会将 PGT 结果输入本地数据库。 IT技术人员将从PGT实验室收集数据库并输入在线软件，根据预先确定的算法编制胚胎移植序列，该算法取决于囊胚发育的日期（第5天优于第6天），囊胚形态学和 niPGT-A 结果。 IT技术人员将胚胎移植序列发布给IVF实验室的胚胎学家，该序列不包含囊胚分级和NIPGT结果的信息。 因此，招募的受试者、临床医生和胚胎学家将对组分配不知情。

我们的 niPGT-A 初步结果 正在进行的 NIPGT-A 试验的初步结果涉及 1168 个 SCM。 收集平行培养但不与胚胎接触的培养基作为对照（n=238）。 在 1158 SCM (99.1%, 1158/1168) 中扩增成功，在 1141 SCM 中得到了确定的结果 (97.6%, 1141/1168)。 所有对照均未显示扩增。

冷冻胚胎移植 (FET) 囊胚可以在随后的自然、来曲唑或激素替代周期中进行替代，具体取决于女性是否有规律的月经周期。 每次只移植一个胚泡。 在对照组中，将首先更换具有最佳形态的囊胚，并在随机化之前确定囊胚移植的顺序。 在干预组中，具有最佳形态和整倍体结果的囊胚将首先被替换，因为囊胚移植的顺序将在 niPGT-A 报告可用后进行修改。

怀孕 转移后 14 天将进行尿液妊娠试验。 如果妊娠试验呈阳性，两周后将进行经阴道超声检查以定位妊娠并确认胎儿的生存能力和胎儿的数量。 后续处理与其他早孕女性相同。 当持续怀孕 8-10 周时，她们将被转介接受产前检查。

与所有因不孕症而接受 IVF 的患者一样，在研究期间将征求妇女关于检索妊娠和分娩数据的书面同意。 分娩后将通过电话联系这些妇女，以检索试管婴儿怀孕后的妊娠结果信息。 将记录妊娠结果（分娩、流产）、出生婴儿数、出生体重和产科并发症。

在第一次 FET 中未能怀孕的女性将被揭盲，如果可用，将更换整倍体胚胎。 如果没有整倍体胚胎，女性可以选择进行第二个试管婴儿周期。