Eine randomisierte kontrollierte Doppelblindstudie zu niPGT-A bei Frauen mit RPL (niPGTA)

Ziele und Zweck der Studie Das primäre Ziel dieser randomisierten kontrollierten Doppelblindstudie ist der Vergleich der Wirksamkeit bei der Embryonenauswahl basierend auf der Morphologie allein mit der Morphologie und niPGT-A bei Frauen mit RPL, die sich dem ersten Transfer eines gefrorenen Embryos unterziehen. Die sekundären Ziele sind die Bewertung der Auswirkungen von eNK-Zellen auf die Fehlgeburts- und Lebendgeburtenraten und die Vorhersage von Lebendgeburten unter Verwendung eines Sphäroid/BAP-EB-Anhaftungsassays.

Zu prüfende Haupthypothesen:

1. Die Embryoselektion basierend auf der Morphologie und niPGT-A für Aneuploidie führt zu einer höheren Lebendgeburtenrate der IVF bei Frauen mit RPL im Vergleich zur Kontrollgruppe allein basierend auf der Morphologie.
2. Die Embryoselektion basierend auf Morphologie und niPGT-A für Aneuploidie führt zu einer niedrigeren Fehlgeburtsrate nach IVF bei Frauen mit RPL im Vergleich zur Kontrollgruppe allein basierend auf Morphologie.

2. Studiendesign Dies ist eine randomisierte kontrollierte Doppelblindstudie. Geeignete Frauen werden für die Studie rekrutiert und nach der Beratung wird eine informierte schriftliche Zustimmung eingeholt.

Beurteilung des Endometriums Bei allen Frauen wird 7 Tage nach dem Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH+7) vor dem Monat der IVF eine Endometriumbiopsie mit einem Pipelle-Probenehmer durchgeführt. Ein Teil der Endometriumproben wird zur immunhistochemischen Färbung von Endometrium-uNK-Zellen mit CD56-Antikörper in Paraformaldehyd fixiert [26,27]. Der andere Teil der Endometriumproben wird zur Isolierung von Epithel- und Stromazellen für den Sphäroid/BAP-EB-Anhaftungsassay [28] verwendet, um die Embryoanhaftungsrate in einer Laborumgebung vorherzusagen. Aufgrund ethischer Probleme und praktischer Schwierigkeiten ist die Verwendung menschlicher Embryonen zur Beurteilung des Endometriums nicht durchführbar. Das BAP-EB-Modell [28] wird in dieser Studie als Ersatz für den Embryo (Blastozyste) verwendet. Das BAP-EB-Sphäroidmodell wird aus menschlichen embryonalen Stammzellen differenziert. Die BAP-EB nach 72 Stunden Differenzierung (BAP-EB-72h) haben eine molekulare Signatur von Tag-7-Trophektodermzellen von Blastozysten [28]. In dieser Studie wird BAP-EB mit primären Endometrium-Epithelzellen kokultiviert und die Anhaftungsrate wird gemäß unserem etablierten Protokoll bestimmt.

IVF-Protokoll Frauen werden je nach Indikation einer IVF mit oder ohne intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) unterzogen. Die Frauen erhalten eine ovarielle Stimulation unter Verwendung des Progestin-geprimten Protokolls [29] oder des Antagonistenprotokolls. Am Tag 2-3 der Menstruation wird eine Ultraschalluntersuchung zur Zählung der Antrumfollikel und zum Ausschluss des Vorhandenseins einer Ovarialzyste angeordnet. Die Östradiol- und Progesteronkonzentrationen im Serum werden überprüft, und wenn sie basal sind, wird eine ovarielle Stimulation mit Gonadotropin-Injektionen (225–300 IE täglich, abhängig von der Antrumfollikelzahl) für 10–12 Tage verabreicht. Provera 10 mg täglich wird von Tag 2-3 bis zum Tag des Triggers im Progestin-vorbereiteten Protokoll verabreicht, um einen vorzeitigen LH-Anstieg zu verhindern, während der GnRH-Antagonist am Tag 6 der ovariellen Stimulation bis zum Tag des Triggers begonnen wird. Regelmäßige Ultraschallüberwachung wird durchgeführt, um das Wachstum der Follikel zu überwachen. Die Anpassung der Gonadotropin-Dosierung erfolgt entsprechend der Anzahl und Größe der Follikel. Wenn drei Follikel einen Durchmesser von >17 mm erreichen, wird ein GnRH-Agonist (Decapeptyl 0,3 mg) oder humanes Choriongonadotropin (Ovidrel 0,25 mg) verabreicht. Die Oozytenentnahme wird 34-36 Stunden nach dem HCG- oder Agonisten-Trigger unter transvaginaler Ultraschallführung geplant.

Eine normale Befruchtung wird durch das Vorhandensein von zwei Vorkernen 16-18 h nach der Befruchtung beurteilt und bestätigt. Alle Embryonen im Teilungsstadium werden einzeln bis zum Blastozystenstadium gezüchtet, normalerweise am 5. oder 6. Tag nach der Oozytenentnahme, in einem monophasischen Medium. An Tag 3 wird das Kulturmedium wieder aufgefüllt und die Kultur wird bei 37 °C und 6 % CO2 in reduzierter Sauerstoffspannung (5 %) fortgesetzt. Im stimulierten Zyklus wird kein frischer Blastozystentransfer durchgeführt.

Einstufung der Blastozyste nach Morphologie

Blastozysten werden gemäß der Gardner-Klassifikation (29) eingestuft. Das Blastozysten-Bewertungssystem weist jedem Blastozysten-Embryo 3 separate Qualitätsbewertungen zu, basierend auf Folgendem:

1. Blastozysten-Entwicklungsstadium: Expansions- und Schlupfstatus
2. Inner cell mass score
3. Trophectoderm-Score

Blastozystenentwicklung und Stadiumsstatus der Expansionsstufe

1. Blastocoel-Höhle weniger als die Hälfte des Volumens des Embryos
2. Blastocoel-Höhle mehr als die Hälfte des Volumens des Embryos
3. Vollständige Blastozyste, Hohlraum, der den Embryo vollständig ausfüllt
4. Ausgedehnte Blastozyste, Hohlraum größer als der Embryo, mit Ausdünnung der Zona pellucida
5. Schlüpfen aus der Zona pellucida
6. Aus der Zona pellucida geschlüpft

Qualität der inneren Zellmasse Qualität der inneren Zellmasse A Viele Zellen, dicht gepackt B Mehrere Zellen, lose gruppiert C Sehr wenige Zellen

Trophectoderm-Qualität Trophectoderm-Qualität A Viele Zellen, die eine kohäsive Schicht bilden B Wenige Zellen, die ein lockeres Epithel bilden C Sehr wenige große Zellen

Blastozysten werden im Entwicklungsstadium mit einem Expansionswert von 3 oder höher kryokonserviert. Erreicht eine Blastozyste am 5. Tag nicht das Expansionsstadium 3, wird am 6. Tag geprüft, ob sie für die Kryokonservierung geeignet ist. Blastozysten mit entweder innerer Zellmasse oder Trophektoderm mit der Bewertung B oder höher werden als verwertbare Blastozysten angesehen.

Jede Blastozyste wird einzeln durch Vitrifikation eingefroren, und ihr SCM (~8 µl) wird separat und einzeln bei -800 °C eingefroren. Der Embryologe erstellt eine Sequenz des Blastozystentransfers basierend auf der besten Morphologie nach den Kriterien von Gardner.

Am Tag der Blastozystenvereisung werden die Frauen dann durch das Laborpersonal im PGT-Labor per Randomisierungsprogramm zufällig in zwei Gruppen im Verhältnis 1:1 eingeteilt.

1. die Interventionsgruppe mit Morphologie und niPGT-A und
2. die Kontrollgruppe allein auf der Grundlage der Morphologie.

Die Frauen und Kliniker werden gegenüber den ihnen zugewiesenen Behandlungsgruppen verblindet. Die Gruppenzuordnung ist nur dem Laborpersonal im PGT-Labor bekannt.

niPGT-A des verbrauchten Kulturmediums (SCM) In der Interventionsgruppe wird ein umfassendes Chromosomenscreening mittels NGS gemäß den Empfehlungen des pU in allen SCM-Proben durchgeführt. In der Kontrollgruppe wird die Messung nachträglich in denjenigen SCM-Proben von Blastozysten durchgeführt, die beim ersten Transfer ersetzt wurden. Alle SCM-Proben werden für mögliche zukünftige Forschung gespeichert.

Zur Analyse von SCM-Proben wird ein im Handel erhältliches NI-PGT-Kit (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT-Kit, PerkinElmer) verwendet. Das Protokoll wurde zuvor mit nicht-invasiven Proben aus 15 Labors auf der ganzen Welt optimiert. Das Kit folgt einem Einzelröhrchen-Workflow, einer zweistufigen PCR zur Amplifikation des gesamten Genoms der DNA in SCM und fügt dann Indizes und sequenzspezifische Adapter an die Matrizen-DNA an, was zu sequenzierfertigen Proben führt.

Nach der Reinigung wird die Konzentration jeder Probe auf äquimolar eingestellt, gepoolt (96 Proben) und dann auf einem MiSeq-System (Illumina) mit einer Leselänge von 1 x 75 bp sequenziert. Die On-Board-Sekundäranalyse wurde automatisch von MiSeq Reporter (Illumina) gefolgt von der PG-Find-Software (v 1.0, PerkinElmer) durchgeführt. Reads, die sich an anomalen, unstrukturierten und sich stark wiederholenden Sequenzen orientieren, werden aus der Analyse herausgefiltert. Es wird eine Ziel-Bin-Größe von 1.000 KB verwendet, was eine Mindestauflösung von 10 MB ergibt. Alle genomischen Positionen beziehen sich auf den Humangenom-Build NCBI 37.

Gemäß der Standardeinstellung der PG-Find-Software wird die Klassifikation der Aneuploidie durch den CNV-Wert (Copy-umber-Variation) bestimmt. Ein CNV-Wert > 2,7 wird als Gewinn betrachtet, während ein CNV-Wert < 1,3 als Verlust betrachtet wird. Die Probe wird als nicht euploid gewertet, wenn eines oder mehrere der Chromosomen einen Gewinn/Verlust aufweisen.

Der niPGT-A-Bericht der SCM-Probe kann euploid, nicht euploid und nicht informativ sein. Es wird nur verwendet, um die Reihenfolge des Embryotransfers zu priorisieren. Blastozysten mit nicht euploidem Ergebnis im niPGT-A-Bericht werden nicht verworfen.

Verblindung Der Embryologe bewertet die Morphologie der Blastozysten gemäß den oben genannten Kriterien von Gardner und gibt die Einstufung der Blastozysten in eine Online-Datenbank ein, die von einem IT-Techniker verwaltet wird. Das Laborpersonal im PGT-Labor wird das PGT-Ergebnis in eine lokale Datenbank eingeben, wenn die NIPGT-Ergebnisse verfügbar sind. Der IT-Techniker sammelt die Datenbank aus dem PGT-Labor und gibt sie in die Online-Software ein, um die Sequenz des Embryotransfers nach einem vorher festgelegten Algorithmus zusammenzustellen, der vom Tag der Blastozystenentwicklung (Tag 5 besser als Tag 6), Blastozyste, abhängt Morphologie und niPGT-A-Ergebnis. Der IT-Techniker wird den Embryologen im IVF-Labor die Sequenz des Embryotransfers ausstellen, die keine Informationen über die Einstufung der Blastozyste und das NIPGT-Ergebnis enthält. Daher werden die rekrutierten Probanden, die Kliniker und die Embryologen gegenüber der Gruppenzuteilung verblindet.

Unsere vorläufigen Ergebnisse von niPGT-A Die vorläufigen Ergebnisse der laufenden NIPGT-A-Studie umfassten 1168 SCM. Parallel kultivierte Medien, jedoch ohne Kontakt mit Embryonen, wurden als Kontrollen gesammelt (n=238). Die Amplifikation war bei 1158 SCM erfolgreich (99,1 %, 1158/1168) und bei 1141 SCM ergab sich ein schlüssiges Ergebnis (97,6 %, 1141/1168). Alle Kontrollen zeigten keine Amplifikation.

Gefrorener Embryotransfer (FET) Blastozysten können in den nachfolgenden natürlichen, Letrozol- oder Hormonersatzzyklen ersetzt werden, je nachdem, ob die Frauen regelmäßige Menstruationszyklen haben oder nicht. Es wird jeweils nur eine Blastozyste übertragen. In der Kontrollgruppe werden Blastozysten mit der qualitativ besten Morphologie zuerst ersetzt und die Reihenfolge des Blastozystentransfers wird vor der Randomisierung festgelegt. In der Interventionsgruppe werden die Blastozysten mit der besten Morphologie und dem euploiden Ergebnis zuerst ersetzt, da die Reihenfolge des Blastozystentransfers geändert wird, nachdem die niPGT-A-Berichte vorliegen.

Schwangerschaft 14 Tage nach dem Transfer wird ein Schwangerschaftstest im Urin durchgeführt. Wenn der Schwangerschaftstest positiv ist, wird zwei Wochen später ein transvaginaler Ultraschall durchgeführt, um die Schwangerschaft zu lokalisieren und die Lebensfähigkeit des Fötus sowie die Anzahl der Föten zu bestätigen. Das nachfolgende Management ist das gleiche wie bei anderen Frauen mit Frühschwangerschaft. Sie werden zur Schwangerschaftsvorsorge überwiesen, wenn die Schwangerschaft 8-10 Wochen dauert.

Nachsorge Wie bei allen Patienten, die wegen Unfruchtbarkeit zur IVF kommen, wird von den Frauen zum Zeitpunkt der Studie eine schriftliche Zustimmung zum Abruf von Schwangerschafts- und Entbindungsdaten eingeholt. Die Frauen werden nach der Entbindung telefonisch kontaktiert, um die Informationen zum Schwangerschaftsausgang routinemäßig nach einer IVF-Schwangerschaft abzurufen. Der Ausgang der Schwangerschaft (Geburt, Fehlgeburt), die Anzahl der geborenen Babys, das Geburtsgewicht und Geburtskomplikationen werden aufgezeichnet.

Frauen, die im ersten FET nicht schwanger werden, werden entblindet und ein euploider Embryo wird ersetzt, falls verfügbar. Wenn kein euploider Embryo vorhanden ist, können sich die Frauen für den zweiten IVF-Zyklus entscheiden.