Рандомизированное двойное слепое контролируемое исследование niPGT-A у женщин с ПНБ (niPGTA)

Цели и задачи исследования Основная цель этого рандомизированного двойного слепого контролируемого исследования состоит в том, чтобы сравнить эффективность отбора эмбрионов, основанную только на морфологии, по сравнению с морфологией и niPGT-A у женщин с ПНБ, подвергшихся первому переносу замороженных эмбрионов. Второстепенными целями являются оценка влияния клеток eNK на частоту выкидышей и живорождений, а также прогнозирование живорождения с использованием анализа прикрепления сфероидов/BAP-EB.

Основные гипотезы, которые необходимо проверить:

1. Отбор эмбрионов на основе морфологии и niPGT-A для анеуплоидии приводит к более высокой частоте рождения живых детей при ЭКО у женщин с ПНБ по сравнению с контрольной группой на основе только морфологии.
2. Отбор эмбрионов на основе морфологии и niPGT-A для анеуплоидии приводит к более низкой частоте выкидышей после ЭКО у женщин с ПНБ по сравнению с контрольной группой на основе только морфологии.

2. Дизайн исследования Это рандомизированное двойное слепое контролируемое исследование. Подходящие женщины будут набраны для исследования, и после консультации будет получено информированное письменное согласие.

Оценка эндометрия У всех женщин будет биопсия эндометрия с использованием пробоотборника Pipelle через 7 дней после выброса лютеинизирующего гормона (LH+7) до месяца проведения ЭКО. Часть образцов эндометрия будет зафиксирована в параформальдегиде для иммуногистохимического окрашивания uNK-клеток эндометрия антителом к ​​CD56 [26,27]. Другая часть образцов эндометрия будет использоваться для выделения эпителиальных и стромальных клеток для анализа прикрепления сфероидов/BAP-EB [28] для прогнозирования скорости прикрепления эмбриона в лабораторных условиях. Из-за этических проблем и практических трудностей использование человеческих эмбрионов для оценки состояния эндометрия нецелесообразно. Модель BAP-EB [28] будет использоваться в качестве суррогата эмбриона (бластоцисты) в этом исследовании. Сфероидная модель BAP-EB дифференцируется из эмбриональных стволовых клеток человека. BAP-EB после 72 ч дифференцировки (BAP-EB-72h) имеют молекулярную сигнатуру клеток трофэктодермы 7-го дня бластоцисты [28]. В этом исследовании BAP-EB будет культивироваться совместно с первичными эпителиальными клетками эндометрия, и скорость прикрепления будет определяться в соответствии с нашим установленным протоколом.

Протокол ЭКО Женщины будут подвергаться ЭКО с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов (ИКСИ) или без нее, как указано. Женщины будут получать стимуляцию яичников с использованием протокола с прогестином [29] или протокола с антагонистами. УЗИ проводят на 2-3 день менструации для подсчета антральных фолликулов и исключения наличия кисты яичника. Концентрация эстрадиола и прогестерона в сыворотке будет проверена, и, если они базальные, будет проведена стимуляция яичников с помощью инъекций гонадотропина (225-300 МЕ ежедневно в зависимости от количества антральных фолликулов) в течение 10-12 дней. Провера 10 мг ежедневно будет вводиться со 2-3 дня до дня триггера в прогестин-праймированном протоколе для предотвращения преждевременного всплеска ЛГ, в то время как антагонист ГнРГ будет начат с 6 дня стимуляции яичников до дня триггера. Для наблюдения за ростом фолликулов будет проводиться регулярный ультразвуковой контроль. Коррекция дозы гонадотропина соответствует количеству и размеру фолликулов. Когда три фолликула достигают >17 мм в диаметре, вводят агонист ГнРГ (Декапептил 0,3 мг) или хорионический гонадотропин человека (Овидрел 0,25 мг). Извлечение ооцитов будет запланировано через 34-36 часов после триггерного введения ХГЧ или агониста под трансвагинальным ультразвуковым контролем.

Нормальное оплодотворение будет оцениваться и подтверждаться наличием двух пронуклеусов через 16-18 часов после осеменения. Все эмбрионы на стадии дробления выращивают индивидуально до стадии бластоцисты, обычно на 5-й или 6-й день после забора ооцитов, в монофазной среде. На 3-й день культуральная среда будет пополнена, и культивирование будет продолжено при 37oC и 6% CO2 при пониженном давлении кислорода (5%). В стимулированном цикле свежий перенос бластоцист не проводится.

Классификация бластоцисты по морфологии

Бластоцисты классифицируются в соответствии с классификацией Гарднера (29). Система оценки бластоцисты присваивает 3 отдельных показателя качества каждому эмбриону бластоцисты на основе следующего:

1. Стадия развития бластоцисты: статус расширения и вылупления
2. Оценка внутренней клеточной массы
3. Оценка трофэктодермы

Степень развития бластоцисты и статус стадии

1. Полость бластоцеля менее половины объема зародыша
2. Полость бластоцеля более половины объема зародыша
3. Полная бластоциста, полость которой полностью заполняет эмбрион
4. Расширенная бластоциста, полость больше, чем у эмбриона, с истончением блестящей оболочки
5. Вылупление из блестящей зоны
6. Вылупился из блестящей зоны

Уровень внутренней клеточной массы Качество внутренней клеточной массы A Много клеток, плотно упакованных B Несколько клеток, слабо сгруппированных C Очень мало клеток

Качество трофэктодермы Качество трофэктодермы A Много клеток, образующих когезивный слой B Мало клеток, образующих рыхлый эпителий C Очень мало крупных клеток

Бластоцисты криоконсервируют на стадии развития с показателем расширения 3 или выше. Если бластоциста не достигает стадии расширения 3 на 5-й день, на 6-й день будет оцениваться ее пригодность для криоконсервации. Бластоцисты с внутренней клеточной массой или трофэктодермой, оцененной как B или выше, считаются утилизируемыми бластоцистами.

Каждая бластоциста будет заморожена витрификацией индивидуально, а ее SCM (~ 8 мкл) будет заморожен при -800 ° C отдельно и индивидуально. Эмбриолог подготовит последовательность переноса бластоцисты на основе наилучшей морфологии по критериям Гарднера.

Затем, в день замораживания бластоцисты, женщины будут случайным образом распределены на две группы в соотношении 1:1 с использованием программы рандомизации персоналом лаборатории PGT.

1. группа вмешательства с использованием морфологии и niPGT-A и
2. контрольная группа, основанная только на морфологии.

Женщины и клиницисты не будут осведомлены о назначенных им группах лечения. О групповом задании будет знать только персонал лаборатории PGT.

niPGT-A отработанной питательной среды (СКМ) В группе вмешательства комплексный хромосомный скрининг с использованием NGS будет проводиться в соответствии с рекомендациями компании во всех образцах СКМ. В контрольной группе измерение будет проводиться ретроспективно в тех образцах СКМ бластоцист, которые замещаются при первом переносе. Все образцы SCM будут сохранены для возможных будущих исследований.

Для анализа образцов SCM будет использоваться коммерчески доступный набор NI-PGT (набор PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT, PerkinElmer). Протокол был предварительно оптимизирован с использованием неинвазивных образцов из 15 лабораторий по всему миру. Набор следует рабочему процессу с одной пробиркой, двухэтапной ПЦР для полного генома, амплификации ДНК в SCM, а затем прикрепляет индексы и адаптеры, специфичные для последовательности, к матричной ДНК, что приводит к секвенированию готовых образцов.

После очистки концентрацию каждого образца доводят до равной молярной, объединяют (96 образцов) и затем секвенируют в системе MiSeq (Illumina) с длиной считывания 1x75 п.н. Встроенный вторичный анализ выполнялся автоматически с помощью MiSeq Reporter (Illumina) с последующим программным обеспечением PG-Find (v 1.0, PerkinElmer). Чтения, соответствующие аномальным, неструктурированным и часто повторяющимся последовательностям, отфильтровываются при анализе. Используется целевой размер ячейки 1000 КБ, что дает минимальное разрешение 10 МБ. Все геномные позиции относятся к сборке генома человека NCBI 37.

В соответствии с настройкой по умолчанию программного обеспечения PG-Find классификация анеуплоидии определяется значением CNV (вариация количества копий). Значение CNV > 2,7 считается выигрышем, а значение CNV < 1,3 считается потерей. Образец будет считаться неэуплоидным, если одна или несколько хромосом продемонстрируют увеличение/утрату.

Отчет niPGT-A образца SCM может быть эуплоидным, неэуплоидным и неинформативным. Он используется только для определения приоритета последовательности переноса эмбрионов. Бластоцисты с неэуплоидным результатом в отчете niPGT-A не будут отброшены.

Ослепление Эмбриолог оценит морфологию бластоцист в соответствии с указанными выше критериями Гарднера и введет классификацию бластоцист в онлайн-базу данных, которой будет управлять ИТ-специалист. Персонал лаборатории PGT введет результат PGT в локальную базу данных, когда будут доступны результаты NIPGT. ИТ-специалист соберет базу данных из лаборатории PGT и введет ее в онлайн-программное обеспечение, чтобы составить последовательность переноса эмбрионов в соответствии с заранее определенным алгоритмом, который зависит от дня развития бластоцисты (5-й день лучше, чем 6-й день), бластоциста морфология и результат niPGT-A. ИТ-специалист выдаст эмбриологам в лаборатории ЭКО последовательность переноса эмбрионов, которая не содержит информации о классификации бластоцисты и результатах NIPGT. Таким образом, набранные субъекты, клиницисты и эмбриологи не будут осведомлены о распределении по группам.

Наши предварительные результаты niPGT-A Предварительные результаты продолжающегося исследования NIPGT-A включали 1168 SCM. Среды, культивируемые параллельно, но без контакта с эмбрионами, собирали в качестве контроля (n=238). Амплификация была успешной при 1158 SCM (99,1%, 1158/1168), а при 1141 SCM был получен убедительный результат (97,6%, 1141/1168). Все контроли не показали усиления.

Перенос замороженных эмбрионов (FET) Бластоцисты могут быть заменены в последующих естественных, летрозоловых или гормональных заместительных циклах, в зависимости от того, имеют ли женщины регулярные менструальные циклы или нет. Каждый раз будет переноситься только одна бластоциста. В контрольной группе в первую очередь будут заменены бластоцисты с морфологией наилучшего качества, и до рандомизации будет определена последовательность переноса бластоцист. В группе вмешательства бластоцисты с наилучшей морфологией и эуплоидным результатом будут заменены первыми, поскольку последовательность переноса бластоцисты будет изменена после того, как будут доступны отчеты niPGT-A.

Беременность Анализ мочи на беременность будет проведен через 14 дней после переноса. Если тест на беременность положительный, через две недели будет проведено трансвагинальное УЗИ, чтобы определить беременность и подтвердить жизнеспособность плода и количество плодов. Последующее ведение будет таким же, как и у других женщин с ранней беременностью. Их направляют на дородовое наблюдение при сроке текущей беременности 8-10 недель.

Последующее наблюдение Письменное согласие на получение данных о беременности и родах будет запрошено у женщин во время исследования, как и у всех пациентов, направляющихся на ЭКО по поводу бесплодия. С женщинами свяжутся после родов по телефону, чтобы получить информацию об исходах беременности в обычном порядке после беременности ЭКО. Исход беременности (роды, выкидыш), число рожденных детей, масса тела при рождении и акушерские осложнения будут записаны.

Женщины, которым не удается забеременеть в ходе первого FET, будут вскрыты, и им будет заменен эуплоидный эмбрион, если он будет доступен. Если нет эуплоидного эмбриона, женщины могут пройти второй цикл ЭКО.