En randomiserad dubbelblind kontrollerad studie av niPGT-A hos kvinnor med RPL (niPGTA)

Försökets mål och syfte Det primära syftet med denna randomiserade dubbelblinda kontrollerade studie är att jämföra effektiviteten i embryoselektion baserat på enbart morfologi kontra morfologi och niPGT-A hos kvinnor med RPL som genomgår den första frysta embryoöverföringen. De sekundära målen är att utvärdera effekten av eNK-celler på antalet missfall och levande födelse och förutsägelsen av levande födsel med hjälp av sfäroid/BAP-EB-anslutningsanalys.

Huvudhypoteser som ska testas:

1. Embryonvalet baserat på morfologi och niPGT-A för aneuploidi resulterar i en högre frekvens av levande födelse av IVF hos kvinnor med RPL jämfört med kontrollgruppen baserat på enbart morfologi.
2. Embryonvalet baserat på morfologi och niPGT-A för aneuploidi resulterar i en lägre missfallsfrekvens efter IVF hos kvinnor med RPL jämfört med kontrollgruppen baserat på enbart morfologi.

2. Försöksdesign Detta är en randomiserad dubbelblind kontrollerad studie. Kvalificerade kvinnor kommer att rekryteras till studien och informerat skriftligt samtycke kommer att erhållas efter rådgivning.

Endometriebedömning Alla kvinnor kommer att göra en endometriebiopsi med hjälp av en Pipelle-provtagare 7 dagar efter luteiniserande hormonökning (LH+7) före månaden för IVF. En del av endometrieproverna kommer att fixeras i paraformaldehyd för immunhistokemisk färgning av endometriala uNK-celler med CD56-antikropp [26,27]. Den andra delen av endometrieproverna kommer att användas för epitel- och stromacellisolering för sfäroid/BAP-EB-vidhäftningsanalys [28], för att förutsäga embryonbindningshastigheten i en laboratoriemiljö. På grund av etiska frågor och praktiska svårigheter är det inte möjligt att använda mänskliga embryon för endometriebedömning. BAP-EB-modellen [28] kommer att användas som embryo (blastocyst) surrogat i denna studie. BAP-EB sfäroidmodeller är differentierade från mänskliga embryonala stamceller. BAP-EB efter 72 timmars differentiering (BAP-EB-72h) har molekylär signatur av dag 7 trophectoderm celler av blastocyster [28]. I denna studie kommer BAP-EB att samodlas med primära endometriepitelceller och vidhäftningshastigheten kommer att bestämmas enligt vårt etablerade protokoll.

IVF-protokoll Kvinnor kommer att genomgå IVF med eller utan intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) enligt indikation. Kvinnorna kommer att få äggstocksstimulering med användning av progestin-primat protokoll [29] eller antagonistprotokoll. Ultraljudsundersökning kommer att ordnas på dag 2-3 av menstruationen för antralfollikeltalet och för att utesluta närvaron av ovariecysta. Serumkoncentrationen av östradiol och progesteron kommer att kontrolleras och om de är basala, ges ovariestimulering med gonadotropininjektioner (225-300 IE dagligen beroende på antralfollikeltalet) i 10-12 dagar. Provera 10 mg dagligen kommer att ges från dag 2-3 till dagen för utlösande i det progestin-primade protokollet för att förhindra för tidig LH-ökning medan GnRH-antagonist kommer att startas på dag 6 av äggstocksstimulering till dagen för utlösande. Regelbunden ultraljudsövervakning kommer att utföras för att övervaka tillväxten av folliklar. Justering av gonadotropindosen motsvarar antalet och storleken på folliklarna. När tre folliklar når >17 mm i diameter kommer GnRH-agonist (Decapeptyl 0,3 mg) eller humant koriongonadotropin (Ovidrel 0,25 mg) att administreras. Oocythämtning kommer att schemaläggas 34-36 timmar efter HCG- eller agonistutlösaren under transvaginal ultraljudsledning.

Normal befruktning kommer att bedömas och bekräftas av närvaron av två pronuklei 16-18 timmar efter insemination. Alla embryon i klyvningsstadiet kommer att odlas individuellt till blastocyststadiet, vanligtvis dag 5 eller 6 efter oocythämtning, i ett monofasiskt medium. På dag 3 kommer odlingsmediet att fyllas på och odlingen kommer att fortsätta vid 37oC och 6% CO2 i reducerad syrespänning (5%). Ingen ny överföring av blastocyster kommer att utföras i den stimulerade cykeln.

Gradering av blastocyst efter morfologi

Blastocyster graderas enligt Gardners klassificering (29). Blastocystgraderingssystemet tilldelar 3 separata kvalitetspoäng till varje blastocystembryo, baserat på följande:

1. Blastocystutvecklingsstadiet: expansion och kläckningsstatus
2. Inre cellmasspoäng
3. Trophectoderm poäng

Expansionsgrad Blastocystutveckling och stadiumstatus

1. Blastocoel hålighet mindre än hälften av embryots volym
2. Blastocoel hålighet mer än hälften av embryots volym
3. Full blastocyst, hålighet som helt fyller embryot
4. Expanderad blastocyst, hålighet större än embryot, med förtunning av zona pellucida
5. Kläckning ur zona pellucida
6. Kläckt ur zona pellucida

Inre cellmasskvalitet Inre cellmasskvalitet A Många celler, tätt packade B Flera celler, löst grupperade C Mycket få celler

Trophectoderm kvalitet Trophectoderm kvalitet A Många celler, bildar ett sammanhängande lager B Få celler, bildar ett löst epitel C Mycket få stora celler

Blastocyster kryokonserveras i utvecklingsstadiet med expansionspoäng 3 eller högre. Om en blastocyst inte når expansionsstadium 3 på dag 5, kommer det att bedömas på dag 6 om den är lämplig för kryokonservering. Blastocyster med antingen inre cellmassa eller trophectoderm med poäng som B eller högre betraktas som användbara blastocyster.

Varje blastocyst kommer att frysas genom förglasning individuellt och dess SCM (~8 µl) kommer att frysas vid -800 C separat och individuellt. Embryologen kommer att förbereda en sekvens av blastocystöverföring baserat på den bästa morfologin enligt Gardners kriterier.

Sedan, på dagen för blastocystfrysning, kommer kvinnor sedan att slumpmässigt fördelas i två grupper i förhållandet 1:1 med hjälp av ett randomiseringsprogram av laboratoriepersonalen i PGT-laboratoriet.

1. interventionsgruppen använder morfologi och niPGT-A och
2. kontrollgruppen baserat på enbart morfologi.

Kvinnorna och klinikerna kommer att bli blinda för de behandlingsgrupper de tilldelas. Endast laboratoriepersonalen i PGT-laboratoriet kommer att känna till gruppuppgiften.

niPGT-A av använt odlingsmedium (SCM) I interventionsgruppen kommer en omfattande kromosomscreening med hjälp av NGS att utföras enligt företagets rekommendationer i alla SCM-prover. I kontrollgruppen kommer mätningen att göras retrospektivt i de SCM-prover av blastocyster som ersätts vid den första överföringen. Alla SCM-prover kommer att sparas för eventuell framtida forskning.

Ett kommersiellt tillgängligt NI-PGT-kit (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT-kit, PerkinElmer) kommer att användas för att analysera SCM-prover. Protokollet har tidigare optimerats med icke-invasiva prover från 15 laboratorier runt om i världen. Satsen följer ett arbetsflöde med ett enda rör, tvåstegs PCR för att hela genomet förstärker DNA i SCM och fäster sedan index och sekvensspecifika adaptrar till mall-DNA, vilket resulterar i sekvenseringsklara prover.

Efter rening justeras koncentrationen av varje prov till lika molar, poolas (96 prover) och sekvenseras sedan på ett MiSeq-system (Illumina) vid 1x75 bp avläsningslängd. Sekundär analys ombord utfördes automatiskt av MiSeq Reporter (Illumina) följt av PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Läsningar som anpassar sig till anomala, ostrukturerade och mycket repetitiva sekvenser filtreras från analysen. En målfackstorlek på 1 000 kb används, vilket ger en minsta upplösning på 10 Mb. Alla genomiska positioner hänvisar till det mänskliga genomet bygger NCBI 37.

Enligt standardinställningen för PG-Find-programvaran bestäms klassificeringen av aneuploidi av CNV-värdet (copy umber variation). CNV-värde >2,7 betraktas som vinst medan CNV-värde <1,3 anses som förlust. Provet kommer att avslutas som icke-euploid när en eller flera av kromosomerna visar vinst/förlust.

NiPGT-A-rapporten för SCM-provet kan vara euploid, icke-euploid och icke-informativ. Den används endast för att prioritera sekvensen av embryoöverföring. Blastocyster med icke-euploida resultat i niPGT-A-rapporten kommer inte att kasseras.

Blindning Embryologen kommer att gradera blastocysters morfologi enligt Gardners kriterier ovan och lägga in klassificeringen av blastocyster i en onlinedatabas, som kommer att hanteras av en IT-tekniker. Laboratoriepersonalen i PGT-laboratoriet kommer att lägga in PGT-resultatet i en lokal databas när NIPGT-resultaten är tillgängliga. IT-teknikern kommer att samla in databasen från PGT-laboratoriet och lägga in den i onlineprogramvaran för att kompilera sekvensen för embryoöverföring enligt en förutbestämd algoritm som beror på dagen för blastocystutveckling (dag 5 bättre än dag 6), blastocyst morfologi och niPGT-A-resultat. IT-teknikern kommer att utfärda sekvensen för embryoöverföring som inte innehåller information om graderingen av blastocysten och NIPGT-resultatet till embryologerna i IVF-laboratoriet. Därför kommer försökspersonerna som rekryteras, klinikerna och embryologerna att bli blinda för grupptilldelningen.

Våra preliminära resultat av niPGT-A Preliminära resultat av den pågående NIPGT-A-studien involverade 1168 SCM. Medier som odlats parallellt men utan kontakt med embryon samlades in som kontroller (n=238). Amplifiering var framgångsrik i 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) och 1141 SCM resulterade i avgörande resultat (97,6%, 1141/1168). Alla kontroller visade ingen förstärkning.

Frozen embryo transfer (FET) Blastocyster kan ersättas i de efterföljande naturliga, letrozol- eller hormonella ersättningscyklerna, beroende på om kvinnorna har regelbundna menstruationscykler eller inte. Endast en blastocyst kommer att överföras varje gång. I kontrollgruppen kommer blastocyster med morfologi av bästa kvalitet att bytas ut först och sekvensen av blastocystöverföringen bestäms innan randomisering. I interventionsgruppen kommer blastocyster med bästa morfologi och bästa euploida resultat att ersättas först eftersom sekvensen för blastocystöverföring kommer att modifieras efter att niPGT-A-rapporterna är tillgängliga.

Graviditet Ett uringraviditetstest kommer att utföras 14 dagar efter förflyttningen. Om graviditetstestet är positivt kommer transvaginalt ultraljud att utföras två veckor senare för att lokalisera graviditeten och bekräfta fostrets livsduglighet och antalet foster. Efterföljande hantering kommer att vara densamma som andra kvinnor med tidig graviditet. De remitteras till mödravård när den pågående graviditeten är 8-10 veckor.

Uppföljning Skriftligt samtycke angående hämtning av graviditets- och förlossningsdata kommer att begäras från kvinnorna vid studietillfället, liksom hos alla patienter som kommer för IVF för infertilitet. Kvinnorna kommer att kontaktas efter förlossningen per telefon för att hämta information om graviditetsutfallen som rutin efter IVF-graviditet. Resultatet av graviditeten (förlossning, missfall), antal födda barn, födelsevikter och obstetriska komplikationer kommer att registreras.

Kvinnor som misslyckas med att bli gravida under den första FET kommer att avblindas och ett euploid embryo kommer att ersättas om det finns tillgängligt. Om inget euploid embryo, kan kvinnorna välja att genomgå den andra IVF-cykeln.