En randomisert dobbeltblind kontrollert prøvelse av niPGT-A hos kvinner med RPL (niPGTA)

Forsøkets mål og formål Hovedmålet med denne randomiserte dobbeltblinde kontrollerte studien er å sammenligne effektiviteten i embryoseleksjon basert på morfologi alene versus morfologi og niPGT-A hos kvinner med RPL som gjennomgår den første frosne embryooverføringen. De sekundære målene er å evaluere virkningen av eNK-celler på spontanabort og levende fødselsrater og prediksjon av levende fødsel ved bruk av sfæroid/BAP-EB-tilknytningsanalyse.

Hovedhypoteser som skal testes:

1. Embryoseleksjonen basert på morfologi og niPGT-A for aneuploidi resulterer i en høyere levende fødselsrate av IVF hos kvinner med RPL sammenlignet med kontrollgruppen basert på morfologi alene.
2. Embryoseleksjonen basert på morfologi og niPGT-A for aneuploidi resulterer i en lavere spontanabortrate etter IVF hos kvinner med RPL sammenlignet med kontrollgruppen basert på morfologi alene.

2. Prøvedesign Dette er en randomisert dobbeltblind kontrollert studie. Kvalifiserte kvinner vil bli rekruttert til studien og informert skriftlig samtykke vil bli innhentet etter rådgivning.

Endometrievurdering Alle kvinner vil ha en endometriebiopsi ved bruk av en Pipelle-prøvetaker 7 dager etter luteiniserende hormonstigning (LH+7) før IVF-måneden. En del av endometrieprøvene vil bli fiksert i paraformaldehyd for immunhistokjemisk farging av endometriale uNK-celler med CD56-antistoff [26,27]. Den andre delen av endometrieprøvene vil bli brukt til epitel- og stromalcelleisolering for sfæroid/BAP-EB-festeanalyse [28], for å forutsi embryofestehastigheten i laboratoriemiljø. På grunn av etiske spørsmål og praktiske vanskeligheter, er bruk av menneskelige embryoer for endometrievurdering ikke mulig. BAP-EB-modellen [28] vil bli brukt som embryo (blastocyst) surrogat i denne studien. BAP-EB sfæroidmodell er differensiert fra menneskelige embryonale stamceller. BAP-EB etter 72 timers differensiering (BAP-EB-72h) har molekylær signatur av dag 7 trophectoderm celler av blastocyster [28]. I denne studien vil BAP-EB bli dyrket sammen med primære endometriale epitelceller og festehastigheten vil bli bestemt i henhold til vår etablerte protokoll.

IVF-protokoll Kvinner vil gjennomgå IVF med eller uten intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI) som angitt. Kvinnene vil motta eggstokkstimulering ved bruk av progestin-primet protokoll [29] eller antagonist protokoll. Ultralydskanning vil bli arrangert på dag 2-3 av menstruasjonen for antral follikkeltelling og for å utelukke tilstedeværelse av ovariecyste. Serum østradiol- og progesteronkonsentrasjon vil bli kontrollert og hvis de er basale, gis eggstokkstimulering med gonadotropin-injeksjoner (225-300 IE daglig avhengig av antral follikkeltelling) i 10-12 dager. Provera 10 mg daglig vil bli gitt fra dag 2-3 til utløserdagen i den progestin-primede protokollen for å forhindre for tidlig LH-stigning mens GnRH-antagonist vil startes på dag 6 av eggstokkstimulering til utløserdagen. Regelmessig ultralydovervåking vil bli utført for å overvåke veksten av follikler. Justering av gonadotropindosen tilsvarer antall og størrelse på folliklene. Når tre follikler når >17 mm i diameter, vil GnRH-agonist (Decapeptyl 0,3 mg) eller humant koriongonadotropin (Ovidrel 0,25 mg) administreres. Uthenting av egg vil bli planlagt 34-36 timer etter HCG eller agonist-utløseren under transvaginal ultralydveiledning.

Normal befruktning vil bli vurdert og bekreftet ved tilstedeværelse av to pronuclei 16-18 timer etter inseminering. Alle embryoer i spaltningsstadiet vil dyrkes individuelt til blastocyststadiet, vanligvis dag 5 eller 6 etter uthenting av oocytter, i et monofasisk medium. På dag 3 vil kulturmediet fylles på, og dyrkingen fortsettes ved 37oC og 6 % CO2 i redusert oksygenspenning (5 %). Ingen ny overføring av blastocyster vil bli utført i den stimulerte syklusen.

Gradering av blastocyst etter morfologi

Blastocyster graderes etter Gardners klassifisering (29). Blastocystgraderingssystemet tildeler 3 separate kvalitetspoeng til hvert blastocystembryo, basert på følgende:

1. Blastocystutviklingsstadium: ekspansjons- og klekkestatus
2. Indre cellemassescore
3. Trophectoderm poengsum

Ekspansjonsgrad Blastocystutvikling og stadiumstatus

1. Blastocoel hulrom mindre enn halvparten av volumet av embryoet
2. Blastocoel hulrom mer enn halvparten av volumet av embryoet
3. Full blastocyst, hulrom som fyller embryoet fullstendig
4. Ekspandert blastocyst, hulrom større enn embryoet, med tynning av zona pellucida
5. Klekking ut av zona pellucida
6. Klekket ut av zona pellucida

Indre cellemassekvalitet Indre cellemassekvalitet A Mange celler, tettpakket B Flere celler, løst gruppert C Svært få celler

Trophectoderm-grad Trophectoderm-kvalitet A Mange celler, danner et sammenhengende lag B Få celler, danner et løst epitel C Svært få store celler

Blastocyster kryokonserveres på utviklingsstadiet med ekspansjonsscore 3 eller høyere. Dersom en blastocyst ikke når ekspansjonsstadium 3 på dag 5, vil det på dag 6 vurderes om den er egnet for kryokonservering. Blastocyster med enten indre cellemasse eller trophectoderm skåret som B eller høyere regnes som brukbare blastocyster.

Hver blastocyst vil bli frosset ved forglasning individuelt og dens SCM (~8 µl) vil bli frosset ved -800C separat og individuelt. Embryologen vil forberede en sekvens av blastocystoverføring basert på den beste morfologien etter Gardners kriterier.

Deretter, på dagen for blastocystfrysing, vil kvinner deretter bli tilfeldig fordelt i to grupper i forholdet 1:1 ved bruk av et randomiseringsprogram av laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet.

1. intervensjonsgruppen ved hjelp av morfologi og niPGT-A og
2. kontrollgruppen basert på morfologi alene.

Kvinnene og klinikerne vil bli blindet for behandlingsgruppene de er tildelt. Kun laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet vil være kjent med gruppeoppgaven.

niPGT-A av brukt kulturmedium (SCM) I intervensjonsgruppen vil det bli utført omfattende kromosomscreening ved bruk av NGS i henhold til anbefalingene fra selskapet i alle SCM-prøver. I kontrollgruppen vil målingen gjøres retrospektivt i de SCM-prøvene av blastocyster som erstattes ved første overføring. Alle SCM-prøver vil bli lagret for mulig fremtidig forskning.

Et kommersielt tilgjengelig NI-PGT-sett (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT-sett, PerkinElmer) vil bli brukt til å analysere SCM-prøver. Protokollen er tidligere optimert med ikke-invasive prøver fra 15 laboratorier rundt om i verden. Settet følger en arbeidsflyt med ett enkelt rør, to-trinns PCR for å forsterke hele genomet i SCM og fester deretter indekser og sekvensspesifikke adaptere til mal-DNA, noe som resulterer i sekvenseringsklare prøver.

Etter rensing justeres konsentrasjonen av hver prøve til like molar, slås sammen (96 prøver) og sekvenseres deretter på et MiSeq-system (Illumina) ved 1x75 bp leselengde. Sekundæranalyse om bord ble utført automatisk av MiSeq Reporter (Illumina) etterfulgt av PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Lesninger som er tilpasset uregelmessige, ustrukturerte og svært repeterende sekvenser, filtreres fra analysen. En målboksstørrelse på 1000 kb brukes, noe som gir en minimumsoppløsning på 10Mb. Alle genomiske posisjoner refererer til det menneskelige genombygget NCBI 37.

I henhold til standardinnstillingen til PG-Find-programvaren, bestemmes klassifisering av aneuploidi av CNV-verdien (copy umber variation). CNV-verdi >2,7 regnes som gevinst mens CNV-verdi <1,3 regnes som tap. Prøven konkluderes som ikke-euploid når ett eller flere av kromosomene viser gevinst/tap.

NiPGT-A-rapporten til SCM-prøven kan være euploid, ikke-euploid og ikke-informativ. Den brukes kun til å prioritere sekvensen av embryooverføring. Blastocyster med ikke-euploid resultat i niPGT-A-rapporten vil ikke bli forkastet.

Blinding Embryologen vil gradere morfologien til blastocyster i henhold til Gardners kriterier angitt ovenfor og legge inn graderingen av blastocyster i en online database, som vil bli administrert av en IT-tekniker. Laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet vil legge inn PGT-resultatet i en lokal database når NIPGT-resultatene er tilgjengelige. IT-teknikeren vil samle databasen fra PGT-laboratoriet og legge den inn i den elektroniske programvaren for å kompilere sekvensen for embryooverføring i henhold til en forhåndsbestemt algoritme som avhenger av dagen for blastocystutvikling (dag 5 bedre enn dag 6), blastocyst morfologi og niPGT-A-resultat. IT-teknikeren vil utstede sekvensen for embryooverføring som ikke inneholder informasjon om gradering av blastocysten og NIPGT-resultatet til embryologene i IVF-laboratoriet. Derfor vil forsøkspersonene som rekrutteres, klinikerne og embryologene bli blindet for gruppetildelingen.

Våre foreløpige resultater av niPGT-A Foreløpige resultater av den pågående NIPGT-A-studien involverte 1168 SCM. Medier dyrket parallelt, men uten kontakt med embryoer, ble samlet inn som kontroller (n=238). Amplifikasjon var vellykket i 1158 SCM (99,1 %, 1158/1168) og 1141 SCM resulterte i avgjørende resultat (97,6 %, 1141/1168). Alle kontroller viste ingen forsterkning.

Frozen embryo transfer (FET) Blastocyster kan erstattes i de påfølgende naturlige, letrozol- eller hormonelle erstatningssyklusene, avhengig av om kvinnene har regelmessige menstruasjonssykluser eller ikke. Bare én blastocyst vil bli overført hver gang. I kontrollgruppen vil blastocyster med morfologi av beste kvalitet erstattes først og sekvensen for blastocystoverføring bestemmes før randomisering. I intervensjonsgruppen vil blastocyster med best morfologi og euploid resultat først erstattes ettersom sekvensen for blastocystoverføring vil bli modifisert etter at niPGT-A-rapportene er tilgjengelige.

Graviditet En uringraviditetstest vil bli utført 14 dager etter overføringen. Hvis graviditetstesten er positiv, vil transvaginal ultralyd bli utført to uker senere for å lokalisere graviditeten og bekrefte fosterets levedyktighet og antall fostre. Etterfølgende behandling vil være den samme som andre kvinner med tidlig graviditet. De vil bli henvist til svangerskapsomsorg når pågående svangerskap er 8-10 uker.

Oppfølging Skriftlig samtykke vedrørende uthenting av svangerskaps- og fødselsdata vil bli innhentet fra kvinnene på studietidspunktet som for alle pasienter som kommer til IVF for infertilitet. Kvinnene vil bli kontaktet etter fødsel på telefon for å hente informasjon om svangerskapsutfall som rutine etter IVF-svangerskap. Utfallet av graviditeten (fødsel, spontanabort), antall fødte babyer, fødselsvekter og obstetriske komplikasjoner vil bli registrert.

Kvinner som ikke klarer å bli gravide i den første FET vil bli avblindet og et euploid embryo vil bli erstattet hvis tilgjengelig. Hvis ingen euploid embryo, kan kvinnene velge å gjennomgå den andre IVF-syklusen.