Een gerandomiseerde dubbelblinde gecontroleerde studie van niPGT-A bij vrouwen met RPL (niPGTA)

Doelstellingen en doel van de studie De primaire doelstelling van deze gerandomiseerde, dubbelblinde, gecontroleerde studie is het vergelijken van de werkzaamheid bij embryoselectie op basis van alleen morfologie versus morfologie en niPGT-A bij vrouwen met RPL die de eerste ingevroren embryotransfer ondergaan. De secundaire doelstellingen zijn het evalueren van de impact van eNK-cellen op het aantal miskramen en levendgeborenen en de voorspelling van levendgeborenen met behulp van een sferoïde/BAP-EB-aanhechtingstest.

Belangrijkste te testen hypothesen:

1. De embryoselectie op basis van morfologie en niPGT-A voor aneuploïdie resulteert in een hoger aantal levendgeborenen van IVF bij vrouwen met RPL in vergelijking met de controlegroep op basis van alleen morfologie.
2. De embryoselectie op basis van morfologie en niPGT-A voor aneuploïdie resulteert in een lager aantal miskramen na IVF bij vrouwen met RPL in vergelijking met de controlegroep op basis van alleen morfologie.

2. Proefopzet Dit is een gerandomiseerde, dubbelblinde, gecontroleerde proef. Geschikte vrouwen zullen worden aangeworven voor de studie en geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen na counseling.

Beoordeling van het endometrium Bij alle vrouwen wordt 7 dagen na de toename van het luteïniserend hormoon (LH+7) voorafgaand aan de maand van IVF een endometriumbiopsie uitgevoerd met behulp van een Pipelle-sampler. Een deel van de endometriummonsters zal worden gefixeerd in paraformaldehyde voor immunohistochemische kleuring van endometrium-uNK-cellen met CD56-antilichaam [26,27]. Het andere deel van de endometriummonsters zal worden gebruikt voor epitheliale en stromale celisolatie voor de sferoïde/BAP-EB-aanhechtingstest [28], om de snelheid van aanhechting van embryo's in een laboratoriumomgeving te voorspellen. Vanwege ethische kwesties en praktische problemen is het gebruik van menselijke embryo's voor endometriumbeoordeling niet haalbaar. Het BAP-EB-model [28] zal in deze studie worden gebruikt als surrogaat voor het embryo (blastocyst). Het BAP-EB-sferoïdemodel onderscheidt zich van menselijke embryonale stamcellen. De BAP-EB na 72 uur differentiatie (BAP-EB-72 uur) hebben een moleculaire signatuur van dag 7 trophectodermcellen van blastocysten [28]. In deze studie zal BAP-EB samen met primaire endometriumepitheelcellen worden gekweekt en zal de hechtingssnelheid worden bepaald volgens ons vastgestelde protocol.

IVF-protocol Vrouwen ondergaan IVF met of zonder intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) zoals aangegeven. De vrouwen zullen ovariële stimulatie krijgen met behulp van het protocol met progestageenprimer [29] of het antagonistische protocol. Echografie zal op dag 2-3 van de menstruatie worden uitgevoerd voor het aantal antrale follikels en om de aanwezigheid van cysten in de eierstokken uit te sluiten. Serumoestradiol- en progesteronconcentraties worden gecontroleerd en als ze basaal zijn, wordt ovariële stimulatie met gonadotropine-injecties (225-300 IE per dag, afhankelijk van het aantal antrale follikels) gedurende 10-12 dagen gegeven. Provera 10 mg per dag zal worden gegeven vanaf dag 2-3 tot dag van trigger in het progestageen-primed protocol om voortijdige LH-piek te voorkomen, terwijl GnRH-antagonist zal worden gestart op dag 6 van ovariële stimulatie tot dag van trigger. Er zal regelmatig echografie worden uitgevoerd om de groei van de follikels te volgen. Aanpassing van de dosering van gonadotropine komt overeen met het aantal en de grootte van de follikels. Wanneer drie follikels >17 mm in diameter bereiken, zal GnRH-agonist (Decapeptyl 0,3 mg) of humaan choriongonadotrofine (Ovidrel 0,25 mg) worden toegediend. Het ophalen van eicellen zal 34-36 uur na de HCG- of agonist-trigger worden gepland onder transvaginale echografie.

Normale bevruchting wordt beoordeeld en bevestigd door de aanwezigheid van twee pronuclei 16-18 uur na inseminatie. Alle embryo's in het splitsingsstadium zullen individueel worden gekweekt tot het blastocyststadium, meestal dag 5 of 6 na het ophalen van de eicel, in een monofasisch medium. Op dag 3 wordt het kweekmedium aangevuld en wordt de kweek voortgezet bij 37oC en 6% CO2 in verminderde zuurstofspanning (5%). Er zal geen nieuwe overdracht van blastocysten worden uitgevoerd in de gestimuleerde cyclus.

Beoordeling van blastocyst door morfologie

Blastocysten worden ingedeeld volgens de classificatie van Gardner (29). Het blastocysten-beoordelingssysteem kent 3 afzonderlijke kwaliteitsscores toe aan elk blastocyste-embryo, op basis van het volgende:

1. Ontwikkelingsfase van de blastocyst: status van expansie en uitkomen
2. Binnenste celmassascore
3. Trophectoderm-score

Expansion grade blastocystontwikkeling en stadiumstatus

1. Blastocoel-holte minder dan de helft van het volume van het embryo
2. Blastocoel-holte meer dan de helft van het volume van het embryo
3. Volledige blastocyst, holte die het embryo volledig vult
4. Uitgebreide blastocyst, holte groter dan het embryo, met dunner worden van de zona pellucida
5. Komt uit de zona pellucida
6. Uitgebroed uit de zona pellucida

Kwaliteit binnencelmassa Binnencelmassakwaliteit A Veel cellen, dicht opeengepakt B Meerdere cellen, losjes gegroepeerd C Zeer weinig cellen

Trophectoderm-kwaliteit Trophectoderm-kwaliteit A Veel cellen, vormen een samenhangende laag B Weinig cellen, vormen een los epitheel C Zeer weinig grote cellen

Blastocysten worden ingevroren in het ontwikkelingsstadium met een expansiescore van 3 of hoger. Als een blastocyst op dag 5 niet het expansiestadium 3 bereikt, wordt op dag 6 beoordeeld of hij geschikt is voor cryopreservatie. Blastocysten met interne celmassa of trophectoderm met een score van B of hoger worden beschouwd als bruikbare blastocysten.

Elke blastocyst wordt afzonderlijk ingevroren door vitrificatie en de SCM (~8 µl) wordt afzonderlijk en afzonderlijk ingevroren bij -80°C. De embryoloog bereidt een reeks blastocystenoverdracht voor op basis van de beste morfologie volgens de criteria van Gardner.

Vervolgens worden de vrouwen op de dag van de bevriezing van de blastocyst willekeurig ingedeeld in twee groepen in een verhouding van 1:1 met behulp van een randomisatieprogramma door het laboratoriumpersoneel in het PGT-laboratorium.

1. de interventiegroep met behulp van morfologie en niPGT-A en
2. de controlegroep alleen op basis van morfologie.

De vrouwen en clinici zullen blind zijn voor de behandelingsgroepen die ze toegewezen krijgen. Alleen de laboratoriummedewerkers in het PGT-laboratorium zijn op de hoogte van de groepsopdracht.

niPGT-A van verbruikt kweekmedium (SCM) In de interventiegroep zal uitgebreide chromosoomscreening met behulp van NGS worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van het bedrijf in alle SCM-monsters. In de controlegroep wordt de meting achteraf uitgevoerd in die SCM-monsters van blastocysten die bij de eerste overdracht worden teruggeplaatst. Alle SCM-samples worden bewaard voor mogelijk toekomstig onderzoek.

Een in de handel verkrijgbare NI-PGT-kit (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT-kit, PerkinElmer) zal worden gebruikt om SCM-monsters te analyseren. Het protocol is eerder geoptimaliseerd met niet-invasieve monsters van 15 laboratoria over de hele wereld. De kit volgt een workflow met één buisje, PCR in twee stappen om het DNA in SCM in het hele genoom te amplificeren en vervolgens indexen en sequentiespecifieke adapters aan template-DNA te bevestigen, wat resulteert in monsters die klaar zijn voor sequencing.

Na zuivering wordt de concentratie van elk monster aangepast tot gelijke molair, samengevoegd (96 monsters) en vervolgens gesequenced op een MiSeq-systeem (Illumina) met een afleeslengte van 1x75 bp. Secundaire analyse aan boord werd automatisch uitgevoerd door de MiSeq Reporter (Illumina) gevolgd door PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Reads die overeenkomen met afwijkende, ongestructureerde en zeer repetitieve sequenties worden uit de analyse gefilterd. Er wordt een doelbakgrootte van 1.000 kb gebruikt, wat een minimale resolutie van 10 Mb oplevert. Alle genomische posities verwijzen naar de opbouw van het menselijk genoom NCBI 37.

Volgens de standaardinstelling van de PG-Find-software wordt de classificatie van aneuploïdie bepaald door de CNV-waarde (kopieervariatie). CNV-waarde >2,7 wordt als winst beschouwd, terwijl CNV-waarde <1,3 als verlies wordt beschouwd. Monster wordt als niet-euploïde geconcludeerd wanneer een of meer van de chromosomen winst/verlies vertonen.

Het niPGT-A-rapport van het SCM-monster kan euploïde, niet-euploïde en niet-informatief zijn. Het wordt alleen gebruikt om prioriteit te geven aan de volgorde van de embryotransfer. Blastocysten met een niet-euploïde resultaat in het niPGT-A-rapport worden niet weggegooid.

Blindering De embryoloog beoordeelt de morfologie van de blastocysten volgens de bovenstaande criteria van Gardner en voert de beoordeling van de blastocysten in een online database in, die wordt beheerd door een IT-technicus. Het laboratoriumpersoneel in het PGT-laboratorium zal het PGT-resultaat invoeren in een lokale database wanneer de NIPGT-resultaten beschikbaar zijn. De IT-technicus verzamelt de database van het PGT-laboratorium en voert deze in de online software in om de volgorde van de embryotransfer samen te stellen volgens een vooraf bepaald algoritme dat afhangt van de dag van ontwikkeling van de blastocyst (dag 5 beter dan dag 6), blastocyst morfologie en niPGT-A resultaat. De IT-technicus zal de embryologen in het IVF-laboratorium de volgorde van de embryotransfer bezorgen die geen informatie bevat over de beoordeling van de blastocyst en het NIPGT-resultaat. Daarom zullen de geworven proefpersonen, de clinici en de embryologen blind zijn voor de groepstoewijzing.

Onze voorlopige resultaten van niPGT-A Voorlopige resultaten van de lopende NIPGT-A-studie betroffen 1168 SCM. Media die parallel werden gekweekt maar zonder contact met embryo's werden verzameld als controles (n=238). Amplificatie was succesvol in 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) en 1141 SCM resulteerde in een overtuigend resultaat (97,6%, 1141/1168). Alle controles vertoonden geen versterking.

Bevroren embryotransfer (FET) Blastocysten kunnen worden vervangen in de daaropvolgende natuurlijke, letrozole of hormonale vervangingscycli, afhankelijk van of de vrouw een regelmatige menstruatiecyclus heeft of niet. Er wordt slechts één blastocyst per keer overgebracht. In de controlegroep worden eerst de blastocysten met de beste kwaliteit morfologie vervangen en wordt de volgorde van de blastocystenoverdracht bepaald voorafgaand aan randomisatie. In de interventiegroep zullen de blastocysten met de beste morfologie en het beste euploïde resultaat als eerste worden vervangen, aangezien de volgorde van de overdracht van blastocysten zal worden gewijzigd nadat de niPGT-A-rapporten beschikbaar zijn.

Zwangerschap 14 dagen na de transfer wordt er een zwangerschapstest in urine gedaan. Als de zwangerschapstest positief is, wordt twee weken later transvaginale echografie uitgevoerd om de zwangerschap te lokaliseren en de levensvatbaarheid van de foetus en het aantal foetussen te bevestigen. De daaropvolgende behandeling zal hetzelfde zijn als bij andere vrouwen met een vroege zwangerschap. Ze worden doorverwezen voor prenatale zorg wanneer de doorgaande zwangerschap 8-10 weken is.

Follow-up Schriftelijke toestemming voor het ophalen van zwangerschaps- en bevallingsgegevens zal worden gevraagd aan de vrouwen op het moment van het onderzoek, zoals bij alle patiënten die voor IVF komen vanwege onvruchtbaarheid. De vrouwen zullen na de bevalling telefonisch gecontacteerd worden om routinematig informatie over de zwangerschapsuitkomsten op te halen na een IVF-zwangerschap. De uitkomst van de zwangerschap (bevalling, miskraam), aantal geboren baby's, geboortegewichten en verloskundige complicaties worden geregistreerd.

Vrouwen die bij de eerste FET niet zwanger raken, worden ontblind en indien beschikbaar wordt een euploïde embryo teruggeplaatst. Als er geen euploïde embryo is, kunnen de vrouwen ervoor kiezen om de tweede IVF-cyclus te ondergaan.