Un ensayo controlado aleatorio doble ciego de niPGT-A en mujeres con RPL (niPGTA)

Objetivos y finalidad del ensayo El objetivo principal de este ensayo controlado aleatorizado, doble ciego, es comparar la eficacia en la selección de embriones basada únicamente en la morfología frente a la morfología y niPGT-A en mujeres con RPL que se someten a la primera transferencia de embriones congelados. Los objetivos secundarios son evaluar el impacto de las células eNK en las tasas de aborto espontáneo y nacimientos vivos y la predicción de nacimientos vivos utilizando el ensayo de unión esferoide/BAP-EB.

Principales hipótesis a probar:

1. La selección de embriones basada en la morfología y niPGT-A para la aneuploidía da como resultado una mayor tasa de nacimientos vivos de FIV en mujeres con RPL en comparación con el grupo de control basado solo en la morfología.
2. La selección de embriones basada en la morfología y niPGT-A para la aneuploidía da como resultado una menor tasa de aborto espontáneo después de la FIV en mujeres con RPL en comparación con el grupo de control basado solo en la morfología.

2. Diseño del ensayo Este es un ensayo controlado aleatorio doble ciego. Las mujeres elegibles serán reclutadas para el estudio y se obtendrá el consentimiento informado por escrito después del asesoramiento.

Evaluación endometrial A todas las mujeres se les realizará una biopsia endometrial con un muestreador Pipelle 7 días después del aumento de la hormona luteinizante (LH+7) antes del mes de la FIV. Parte de las muestras endometriales se fijarán en paraformaldehído para la tinción inmunohistoquímica de células uNK endometriales con anticuerpos CD56 [26,27]. La otra parte de las muestras de endometrio se utilizará para el aislamiento de células epiteliales y estromales para el ensayo de fijación de esferoides/BAP-EB [28], para predecir la tasa de fijación de embriones en un entorno de laboratorio. Debido a cuestiones éticas y dificultades prácticas, el uso de embriones humanos para la evaluación del endometrio no es factible. El modelo BAP-EB [28] se utilizará como sustituto del embrión (blastocisto) en este estudio. El modelo esferoide BAP-EB se diferencia de las células madre embrionarias humanas. El BAP-EB después de 72 horas de diferenciación (BAP-EB-72h) tiene la firma molecular de las células trofoectodérmicas del día 7 de los blastocistos [28]. En este estudio, BAP-EB se cocultivará con células epiteliales endometriales primarias y la tasa de unión se determinará de acuerdo con nuestro protocolo establecido.

Protocolo de FIV Las mujeres se someterán a FIV con o sin inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), según se indique. Las mujeres recibirán estimulación ovárica utilizando el protocolo cebado con progestina [29] o el protocolo antagonista. Se programará una ecografía el día 2 o 3 de la menstruación para el recuento de folículos antrales y para descartar la presencia de un quiste ovárico. Se comprobará la concentración sérica de estradiol y progesterona y, si son basales, se administrará estimulación ovárica con inyecciones de gonadotropina (225-300 UI diarias dependiendo del recuento de folículos antrales) durante 10-12 días. Se administrarán 10 mg diarios de Provera desde el día 2 o 3 hasta el día de activación en el protocolo de preparación con progestina para evitar el aumento prematuro de LH, mientras que el antagonista de GnRH se iniciará desde el día 6 desde la estimulación ovárica hasta el día de activación. Se realizará un control ecográfico regular para controlar el crecimiento de los folículos. El ajuste de la dosis de gonadotropina corresponde al número y tamaño de los folículos. Cuando tres folículos alcancen >17 mm de diámetro, se administrará agonista de GnRH (Decapeptyl 0,3 mg) o gonadotropina coriónica humana (Ovidrel 0,25 mg). La recuperación de ovocitos se programará 34-36 horas después de la activación de HCG o agonista bajo guía de ultrasonido transvaginal.

La fecundación normal será evaluada y confirmada por la presencia de dos pronúcleos a las 16-18 h después de la inseminación. Todos los embriones en etapa de escisión crecerán individualmente hasta la etapa de blastocisto, generalmente el día 5 o 6 después de la recuperación del ovocito, en un medio monofásico. El día 3, se repondrá el medio de cultivo y se continuará con el cultivo a 37 oC y 6 % de CO2 en tensión de oxígeno reducida (5 %). No se realizará ninguna transferencia fresca de blastocistos en el ciclo estimulado.

Clasificación de blastocisto por morfología

Los blastocistos se clasifican según la clasificación de Gardner (29). El sistema de clasificación de blastocistos asigna 3 puntajes de calidad separados a cada embrión de blastocisto, según lo siguiente:

1. Etapa de desarrollo del blastocisto: estado de expansión y eclosión
2. Puntuación de la masa celular interna
3. Puntuación de trofoectodermo

Grado de expansión Desarrollo del blastocisto y estado del estadio

1. Cavidad de blastocoel menos de la mitad del volumen del embrión
2. Cavidad de blastocoel más de la mitad del volumen del embrión
3. Blastocisto lleno, cavidad que llena completamente el embrión
4. Blastocisto expandido, cavidad más grande que el embrión, con adelgazamiento de la zona pelúcida
5. Eclosión de la zona pelúcida
6. Nacido de la zona pelúcida

Grado de la masa celular interna Calidad de la masa celular interna A Muchas células, apretadas B Varias células, agrupadas libremente C Muy pocas células

Grado de trofoectodermo Calidad de trofoectodermo A Muchas células, formando una capa cohesiva B Pocas células, formando un epitelio laxo C Muy pocas células grandes

Los blastocistos se crioconservan en la etapa de desarrollo con una puntuación de expansión de 3 o superior. Si un blastocisto no alcanza el estadio de expansión 3 el día 5, se evaluará el día 6 si es apto para la criopreservación. Los blastocistos con masa celular interna o trofectodermo clasificados como B o superior se consideran blastocistos utilizables.

Cada blastocisto se congelará por vitrificación individualmente y su SCM (~ 8 l) se congelará a -800C por separado e individualmente. El embriólogo preparará una secuencia de transferencia de blastocistos en base a la mejor morfología según los criterios de Gardner.

Luego, el día de la congelación del blastocisto, el personal del laboratorio PGT asignará aleatoriamente a las mujeres en dos grupos en una proporción de 1:1 utilizando un programa de aleatorización.

1. el grupo de intervención usando morfología y niPGT-A y
2. el grupo de control basándose únicamente en la morfología.

Las mujeres y los médicos estarán cegados a los grupos de tratamiento que se les asignen. Solo el personal de laboratorio en el laboratorio PGT estará al tanto de la asignación del grupo.

niPGT-A de medio de cultivo usado (SCM) En el grupo de intervención, se realizará un cribado cromosómico completo mediante NGS según las recomendaciones de la empresa en todas las muestras de SCM. En el grupo control, la medición se realizará de forma retrospectiva en aquellas muestras SCM de blastocistos que se repongan en la primera transferencia. Todas las muestras de SCM se guardarán para posibles investigaciones futuras.

Se utilizará un kit NI-PGT disponible comercialmente (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT kit, PerkinElmer) para analizar las muestras de SCM. El protocolo se ha optimizado previamente con muestras no invasivas de 15 laboratorios de todo el mundo. El kit sigue un flujo de trabajo de un solo tubo, PCR de dos pasos para amplificar el genoma completo del ADN en SCM y luego adjunta índices y adaptadores específicos de secuencia a la plantilla de ADN, lo que da como resultado muestras listas para la secuenciación.

Después de la purificación, la concentración de cada muestra se ajusta en molares iguales, se agrupan (96 muestras) y luego se secuencian en un sistema MiSeq (Illumina) con una longitud de lectura de 1x75 pb. El análisis secundario integrado se realizó automáticamente con MiSeq Reporter (Illumina), seguido de PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Las lecturas que se alinean con secuencias anómalas, no estructuradas y altamente repetitivas se filtran del análisis. Se utiliza un tamaño de contenedor de destino de 1000 kb, lo que proporciona una resolución mínima de 10 Mb. Todas las posiciones genómicas se refieren a la construcción del genoma humano NCBI 37.

De acuerdo con la configuración predeterminada del software PG-Find, la clasificación de la aneuploidía está determinada por el valor CNV (variación del número de copia). El valor CNV >2,7 se considera ganancia, mientras que el valor CNV <1,3 se considera pérdida. La muestra se concluirá como no euploide cuando uno o más de los cromosomas muestre ganancia/pérdida.

El informe de niPGT-A de la muestra SCM puede ser euploide, no euploide y no informativo. Se utiliza únicamente para priorizar la secuencia de transferencia de embriones. No se descartarán blastocistos con resultado no euploid en el informe niPGT-A.

Cegamiento El embriólogo calificará la morfología de los blastocistos de acuerdo con los criterios de Gardner mencionados anteriormente e ingresará la calificación de los blastocistos en una base de datos en línea, que será administrada por un técnico de TI. El personal del laboratorio del PGT ingresará el resultado del PGT en una base de datos local cuando los resultados del NIPGT estén disponibles. El técnico de TI recopilará la base de datos del laboratorio PGT y la ingresará en el software en línea para compilar la secuencia de transferencia de embriones de acuerdo con un algoritmo predeterminado que depende del día de desarrollo del blastocisto (día 5 mejor que día 6), blastocisto Morfología y resultado de niPGT-A. El técnico de TI emitirá la secuencia de transferencia de embriones que no contiene información sobre la clasificación del blastocisto y el resultado de la NIPGT a los embriólogos en el laboratorio de FIV. Por lo tanto, los sujetos reclutados, los médicos y los embriólogos estarán cegados a la asignación de grupos.

Nuestros resultados preliminares de niPGT-A Los resultados preliminares del ensayo NIPGT-A en curso incluyeron 1168 SCM. Los medios cultivados en paralelo pero sin contacto con los embriones se recolectaron como controles (n=238). La amplificación fue exitosa en 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) y 1141 SCM resultó en un resultado concluyente (97,6%, 1141/1168). Todos los controles no mostraron amplificación.

Los blastocistos de transferencia de embriones congelados (FET, por sus siglas en inglés) se pueden reemplazar en los ciclos posteriores de reemplazo natural, letrozol u hormonal, dependiendo de si las mujeres tienen ciclos menstruales regulares o no. Solo se transferirá un blastocisto cada vez. En el grupo de control, los blastocistos con la morfología de mejor calidad se reemplazarán primero y la secuencia de transferencia de blastocistos se decidirá antes de la aleatorización. En el grupo de intervención, se reemplazarán primero los blastocistos con la mejor morfología y resultado euploide, ya que la secuencia de transferencia de blastocistos se modificará una vez que estén disponibles los informes de niPGT-A.

Embarazo Se realizará una prueba de embarazo en orina 14 días después de la transferencia. Si la prueba de embarazo es positiva, dos semanas después se realizará una ecografía transvaginal para localizar el embarazo y confirmar la viabilidad fetal y el número de fetos. El manejo posterior será el mismo que el de otras mujeres con embarazo temprano. Serán derivadas para atención prenatal cuando el embarazo en curso tenga entre 8 y 10 semanas.

Seguimiento Se solicitará a las mujeres el consentimiento por escrito con respecto a la recuperación de los datos de embarazo y parto en el momento del estudio, como en todas las pacientes que acuden a FIV por infertilidad. Se contactará a las mujeres después del parto por teléfono para recuperar la información de los resultados del embarazo como rutina después del embarazo por FIV. Se registrará el resultado del embarazo (parto, aborto espontáneo), número de bebés nacidos, pesos al nacer y complicaciones obstétricas.

Las mujeres que no queden embarazadas en el primer FET no serán cegadas y se reemplazará un embrión euploide si está disponible. Si no hay embrión euploide, la mujer puede optar por someterse al segundo ciclo de FIV.