Uno studio controllato randomizzato in doppio cieco di niPGT-A in donne con RPL (niPGTA)

Obiettivi e scopo dello studio L'obiettivo principale di questo studio controllato randomizzato in doppio cieco è confrontare l'efficacia nella selezione degli embrioni basata solo sulla morfologia rispetto alla morfologia e niPGT-A nelle donne con RPL sottoposte al primo trasferimento di embrioni congelati. Gli obiettivi secondari sono valutare l'impatto delle cellule eNK sull'aborto spontaneo e sui tassi di nascita dal vivo e la previsione della nascita dal vivo utilizzando il test di attaccamento sferoide/BAP-EB.

Principali ipotesi da verificare:

1. La selezione degli embrioni basata sulla morfologia e niPGT-A per l'aneuploidia si traduce in un più alto tasso di nati vivi di fecondazione in vitro nelle donne con RPL rispetto al gruppo di controllo basato solo sulla morfologia.
2. La selezione dell'embrione basata sulla morfologia e niPGT-A per l'aneuploidia si traduce in un tasso di aborto spontaneo inferiore dopo fecondazione in vitro nelle donne con RPL rispetto al gruppo di controllo basato sulla sola morfologia.

2. Trial Design Questo è uno studio controllato randomizzato in doppio cieco. Le donne idonee saranno reclutate per lo studio e il consenso informato scritto sarà ottenuto dopo la consulenza.

Valutazione dell'endometrio Tutte le donne verranno sottoposte a una biopsia endometriale utilizzando un campionatore Pipelle 7 giorni dopo il picco dell'ormone luteinizzante (LH+7) prima del mese di fecondazione in vitro. Parte dei campioni endometriali saranno fissati in paraformaldeide per la colorazione immunoistochimica delle cellule uNK endometriali con anticorpi CD56 [26,27]. L'altra parte dei campioni endometriali verrà utilizzata per l'isolamento delle cellule epiteliali e stromali per l'analisi dell'attaccamento sferoide/BAP-EB [28], per prevedere il tasso di attaccamento dell'embrione in un ambiente di laboratorio. A causa di questioni etiche e difficoltà pratiche, l'uso di embrioni umani per la valutazione dell'endometrio non è fattibile. Il modello BAP-EB [28] verrà utilizzato come surrogato dell'embrione (blastocisti) in questo studio. Il modello sferoide BAP-EB è differenziato dalle cellule staminali embrionali umane. Il BAP-EB dopo 72 ore di differenziazione (BAP-EB-72h) ha la firma molecolare delle cellule trofectodermiche del giorno 7 delle blastocisti [28]. In questo studio, BAP-EB sarà co-coltivato con cellule epiteliali endometriali primarie e il tasso di attacco sarà determinato secondo il nostro protocollo stabilito.

Protocollo di fecondazione in vitro Le donne saranno sottoposte a fecondazione in vitro con o senza iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) come indicato. Le donne riceveranno la stimolazione ovarica utilizzando il protocollo progestinico [29] o il protocollo antagonista. La scansione ecografica sarà disposta il giorno 2-3 delle mestruazioni per la conta dei follicoli antrali e per escludere la presenza di cisti ovariche. Verranno controllate le concentrazioni sieriche di estradiolo e progesterone e, se sono basali, verrà somministrata stimolazione ovarica con iniezioni di gonadotropine (225-300 UI al giorno a seconda della conta dei follicoli antrali) per 10-12 giorni. Provera 10 mg al giorno verrà somministrato dal giorno 2-3 al giorno del trigger nel protocollo innescato dal progestinico per prevenire il picco prematuro di LH mentre l'antagonista del GnRH verrà avviato dal giorno 6 della stimolazione ovarica al giorno del trigger. Verrà eseguito un monitoraggio ecografico regolare per monitorare la crescita dei follicoli. La regolazione del dosaggio delle gonadotropine corrisponde al numero e alla dimensione dei follicoli. Quando tre follicoli raggiungono un diametro >17 mm, verrà somministrato l'agonista del GnRH (Decapeptyl 0,3 mg) o la gonadotropina corionica umana (Ovidrel 0,25 mg). Il recupero degli ovociti sarà programmato 34-36 ore dopo l'innesco dell'HCG o dell'agonista sotto guida ecografica transvaginale.

La normale fecondazione sarà valutata e confermata dalla presenza di due pronuclei a 16-18 h dall'inseminazione. Tutti gli embrioni allo stadio di clivaggio verranno cresciuti individualmente allo stadio di blastocisti, di solito il giorno 5 o 6 dopo il prelievo degli ovociti, in un terreno monofasico. Il giorno 3, il terreno di coltura sarà riempito e la coltura sarà continuata a 37°C e 6% CO2 in tensione di ossigeno ridotta (5%). Nessun nuovo trasferimento di blastocisti verrà eseguito nel ciclo stimolato.

Classificazione della blastocisti in base alla morfologia

Le blastocisti sono classificate secondo la classificazione di Gardner (29). Il sistema di classificazione della blastocisti assegna 3 punteggi di qualità separati a ciascun embrione di blastocisti, sulla base di quanto segue:

1. Stadio di sviluppo della blastocisti: espansione e stato di schiusa
2. Punteggio di massa cellulare interna
3. Punteggio del trofectoderma

Grado di espansione Sviluppo della blastocisti e stato dello stadio

1. Cavità del blastocele inferiore alla metà del volume dell'embrione
2. Cavità del blastocele più della metà del volume dell'embrione
3. Blastocisti piene, cavità che riempiono completamente l'embrione
4. Blastocisti espansa, cavità più grande dell'embrione, con assottigliamento della zona pellucida
5. Uscire dalla zona pellucida
6. Nato dalla zona pellucida

Grado di massa della cella interna Qualità della massa della cella interna A Molte celle, compattate B Diverse celle, raggruppate in modo lasco C Pochissime celle

Grado di trofectoderma Qualità di trofectoderma A Molte cellule, che formano uno strato coesivo B Poche cellule, che formano un epitelio lasso C Pochissime cellule grandi

Le blastocisti sono criopreservate in fase di sviluppo con un punteggio di espansione pari o superiore a 3. Se una blastocisti non raggiunge lo stadio di espansione 3 al giorno 5, al giorno 6 verrà valutato se è adatta alla crioconservazione. Le blastocisti con massa cellulare interna o trofectoderma con punteggio B o superiore sono considerate blastocisti utilizzabili.

Ogni blastocisti sarà congelata per vetrificazione individualmente e il suo SCM (~8 µl) sarà congelato a -800C separatamente e individualmente. L'embriologo preparerà una sequenza di trasferimento di blastocisti basata sulla migliore morfologia secondo i criteri di Gardner.

Quindi, il giorno del congelamento della blastocisti, le donne verranno quindi assegnate in modo casuale in due gruppi in rapporto 1: 1 utilizzando un programma di randomizzazione da parte del personale di laboratorio nel laboratorio PGT.

1. il gruppo di intervento utilizzando morfologia e niPGT-A e
2. il gruppo di controllo basato solo sulla morfologia.

Le donne e i medici saranno all'oscuro dei gruppi di trattamento a loro assegnati. Solo il personale di laboratorio del laboratorio PGT sarà a conoscenza dell'assegnazione del gruppo.

niPGT-A del mezzo di coltura esaurito (SCM) Nel gruppo di intervento, verrà eseguito uno screening cromosomico completo utilizzando NGS secondo le raccomandazioni dell'azienda in tutti i campioni di SCM. Nel gruppo di controllo, la misurazione sarà effettuata retrospettivamente in quei campioni SCM di blastocisti che vengono sostituiti nel primo trasferimento. Tutti i campioni SCM verranno salvati per eventuali ricerche future.

Un kit NI-PGT disponibile in commercio (kit PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT, PerkinElmer) verrà utilizzato per analizzare i campioni di SCM. Il protocollo è stato precedentemente ottimizzato con campioni non invasivi provenienti da 15 laboratori in tutto il mondo. Il kit segue un flusso di lavoro a provetta singola, la PCR in due fasi sull'intero genoma amplifica il DNA in SCM e quindi collega gli indici e gli adattatori specifici della sequenza al DNA modello, ottenendo campioni pronti per il sequenziamento.

Dopo la purificazione, la concentrazione di ciascun campione viene regolata in molare uguale, raggruppata (96 campioni) e quindi sequenziata su un sistema MiSeq (Illumina) a una lunghezza di lettura di 1x75 bp. L'analisi secondaria integrata è stata eseguita automaticamente da MiSeq Reporter (Illumina) seguito da PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Le letture allineate a sequenze anomale, non strutturate e altamente ripetitive vengono filtrate dall'analisi. Viene utilizzata una dimensione bin di destinazione di 1.000 kb, con una risoluzione minima di 10 Mb. Tutte le posizioni genomiche si riferiscono alla build del genoma umano NCBI 37.

In base all'impostazione predefinita del software PG-Find, la classificazione dell'aneuploidia è determinata dal valore CNV (variazione del numero di copie). Il valore CNV >2.7 è considerato come guadagno mentre il valore CNV <1.3 è considerato come perdita. Il campione verrà concluso come non euploide quando uno o più cromosomi mostrano guadagno/perdita.

Il rapporto niPGT-A del campione SCM può essere euploide, non euploide e non informativo. Viene utilizzato solo per dare la priorità alla sequenza del trasferimento dell'embrione. Le blastocisti con risultato non euploide nel rapporto niPGT-A non verranno scartate.

Blinding L'embriologo classificherà la morfologia delle blastocisti secondo i criteri di Gardner sopra indicati e inserirà la classificazione delle blastocisti in un database online, che sarà gestito da un tecnico informatico. Il personale di laboratorio nel laboratorio PGT inserirà il risultato PGT in un database locale quando i risultati NIPGT saranno disponibili. Il tecnico informatico raccoglierà il database dal laboratorio PGT e lo inserirà nel software online per compilare la sequenza di trasferimento dell'embrione secondo un algoritmo predeterminato che dipende dal giorno di sviluppo della blastocisti (giorno 5 migliore del giorno 6), blastocisti morfologia e risultato niPGT-A. Il tecnico informatico rilascerà agli embriologi del laboratorio di fecondazione in vitro la sequenza del trasferimento embrionale che non contiene informazioni sulla classificazione della blastocisti e sul risultato NIPGT. Pertanto, i soggetti reclutati, i clinici e gli embriologi saranno all'oscuro dell'allocazione del gruppo.

I nostri risultati preliminari di niPGT-A I risultati preliminari dello studio NIPGT-A in corso hanno coinvolto 1168 SCM. I terreni coltivati ​​in parallelo ma senza contatto con gli embrioni sono stati raccolti come controlli (n=238). L'amplificazione ha avuto successo in 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) e 1141 SCM ha portato a un risultato conclusivo (97,6%, 1141/1168). Tutti i controlli non hanno mostrato amplificazione.

Trasferimento di embrioni congelati (FET) Le blastocisti possono essere sostituite nei successivi cicli naturali, di letrozolo o di sostituzione ormonale, a seconda che le donne abbiano o meno cicli mestruali regolari. Verrà trasferita solo una blastocisti ogni volta. Nel gruppo di controllo, le blastocisti con la migliore qualità morfologica verranno sostituite per prime e la sequenza del trasferimento delle blastocisti verrà decisa prima della randomizzazione. Nel gruppo di intervento, le blastocisti con la migliore morfologia e risultato euploide saranno sostituite per prime poiché la sequenza del trasferimento di blastocisti verrà modificata dopo che i rapporti niPGT-A saranno disponibili.

Gravidanza Un test di gravidanza sulle urine verrà eseguito 14 giorni dopo il trasferimento. Se il test di gravidanza è positivo, l'ecografia transvaginale verrà eseguita due settimane dopo per individuare la gravidanza e confermare la vitalità fetale e il numero di feti. La gestione successiva sarà la stessa delle altre donne con gravidanza precoce. Saranno indirizzate all'assistenza prenatale quando la gravidanza in corso è di 8-10 settimane.

Follow-up Il consenso scritto per quanto riguarda il recupero dei dati sulla gravidanza e sul parto sarà richiesto dalle donne al momento dello studio come in tutti i pazienti che si sottopongono a fecondazione in vitro per infertilità. Le donne saranno contattate telefonicamente dopo il parto per recuperare le informazioni sugli esiti della gravidanza come routine dopo la gravidanza IVF. Verranno registrati l'esito della gravidanza (parto, aborto spontaneo), il numero di bambini nati, il peso alla nascita e le complicanze ostetriche.

Le donne che non riescono a rimanere incinte nel primo FET saranno aperte e un embrione euploide verrà sostituito se disponibile. Se nessun embrione euploide, le donne possono scegliere di sottoporsi al secondo ciclo di fecondazione in vitro.