RPL을 가진 여성에서 niPGT-A의 무작위 이중 맹검 대조 시험 (niPGTA)

시험 목적 및 목적 이 무작위 이중 맹검 대조 시험의 1차 목적은 첫 번째 냉동 배아 이식을 받는 RPL을 가진 여성에서 형태 단독 대 형태 및 niPGT-A를 기반으로 한 배아 선택의 효능을 비교하는 것입니다. 2차 목표는 회전 타원체/BAP-EB 부착 분석을 사용하여 eNK 세포가 유산 및 정상 출생률 및 정상 출생 예측에 미치는 영향을 평가하는 것입니다.

테스트할 주요 가설:

1. 형태학 및 이수배수체에 대한 niPGT-A를 기반으로 한 배아 선택은 형태학만을 기반으로 한 대조군과 비교하여 RPL이 있는 여성에서 IVF의 더 높은 생존 출산율을 초래합니다.
2. 형태학 및 이수성에 대한 niPGT-A에 기초한 배아 선택은 형태학만을 기초로 한 대조군과 비교하여 RPL이 있는 여성에서 IVF 후 유산율이 더 낮습니다.

2. 시험 설계 이것은 무작위 이중 맹검 통제 시험입니다. 적격 여성이 연구를 위해 모집되고 상담 후 사전 서면 동의를 얻을 것입니다.

자궁내막 평가 모든 여성은 IVF를 받기 전 황체형성 호르몬 급증(LH+7) 후 7일에 Pipelle 샘플러를 사용하여 자궁내막 생검을 받습니다. 자궁내막 샘플의 일부는 CD56 항체[26,27]로 자궁내막 uNK 세포의 면역조직화학적 염색을 위해 파라포름알데히드에 고정될 것입니다. 자궁내막 샘플의 다른 부분은 실험실 환경에서 배아 부착률을 예측하기 위해 스페로이드/BAP-EB 부착 분석[28]을 위한 상피 및 간질 세포 분리에 사용됩니다. 윤리적 문제와 실질적인 어려움으로 인해 자궁 내막 평가를 위해 인간 배아를 사용하는 것은 불가능합니다. BAP-EB 모델[28]은 이 연구에서 배아(배반포) 대용물로 사용됩니다. BAP-EB 스페로이드 모델은 인간 배아 줄기 세포와 구별됩니다. 분화 72시간 후의 BAP-EB(BAP-EB-72h)는 배반포의 7일 영양외배엽 세포의 분자 시그니처를 갖는다[28]. 이 연구에서 BAP-EB는 일차 자궁내막 상피 세포와 함께 배양될 것이며 부착률은 우리가 확립한 프로토콜에 따라 결정될 것입니다.

IVF 프로토콜 여성은 표시된 대로 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 포함하거나 포함하지 않고 IVF를 받게 됩니다. 여성은 프로게스틴 프라이밍 프로토콜[29] 또는 길항제 프로토콜을 사용하여 난소 자극을 받게 됩니다. 월경 2-3일째에 초음파 스캐닝을 실시하여 난포 수를 확인하고 난소 낭종의 존재를 배제합니다. 혈중 에스트라디올과 프로게스테론 농도를 확인하고 기본이면 10-12일 동안 성선자극호르몬 주사(전난포 수에 따라 매일 225-300 IU)로 난소 자극을 줍니다. 조기 LH 급증을 방지하기 위해 프로게스틴 프라이밍 프로토콜에서 프로게스틴-프라이밍 프로토콜에서 유발일까지 Provera 10mg을 매일 투여하고 GnRH 길항제를 난소 자극 6일째부터 유발일까지 시작합니다. 난포의 성장을 모니터링하기 위해 정기적인 초음파 모니터링이 수행됩니다. 성선자극호르몬 투여량의 조절은 난포의 수와 크기에 따라 결정됩니다. 3개의 난포가 직경 17mm 이상에 도달하면 GnRH 작용제(Decapeptyl 0.3mg) 또는 인간 융모성 성선자극호르몬(Ovidrel 0.25mg)을 투여합니다. 난모세포 회수는 경질 초음파 안내 하에서 HCG 또는 작용제 트리거 후 34-36시간에 예정됩니다.

정상적인 수정은 수정 후 16-18시간에 2개의 전핵의 존재에 의해 평가 및 확인됩니다. 모든 절단 단계 배아는 단상 배지에서 일반적으로 난자 회수 후 5일 또는 6일에 배반포 단계까지 개별적으로 성장합니다. 3일째에 배양 배지를 보충하고 37oC, 감소된 산소 분압(5%)에서 6% CO2에서 배양을 계속합니다. 배반포의 새로운 이식은 자극주기에서 수행되지 않습니다.

형태학에 의한 배반포의 등급

배반포는 Gardner의 분류(29)에 따라 등급이 매겨집니다. 배반포 등급 시스템은 다음을 기준으로 각 배반포 배아에 3개의 개별 품질 점수를 할당합니다.

1. 배반포 발달 단계 : 확장 및 부화 상태
2. 내부 세포 질량 점수
3. Trophectoderm 점수

확장 등급 배반포 발달 및 단계 상태

1. 배아 부피의 절반 미만인 배반강
2. 배아 부피의 절반 이상인 배반강
3. 전체 배반포, 배아를 완전히 채우는 공동
4. 확장된 배반포, 배아보다 큰 공동, 투명대(zona pellucida)가 얇아짐
5. Zona pellucida에서 부화
6. zona pellucida에서 부화

내부 세포 덩어리 등급 내부 세포 덩어리 품질 A 많은 세포, 조밀하게 밀집됨 B 여러 세포, 느슨하게 그룹화됨 C 매우 적은 수의 세포

영양외배엽 등급 영양외배엽 품질 A 응집층을 형성하는 많은 세포 B 느슨한 상피를 형성하는 소수의 세포 C 매우 적은 수의 큰 세포

배반포는 확장 점수 3 이상인 발달 단계에서 동결 보존됩니다. 배반포가 5일째 확장 단계 3에 도달하지 않으면 6일째에 동결 보존에 적합한지 여부를 평가합니다. 내부 세포 덩어리 또는 영양 외배엽이 B 이상인 배반포는 활용 가능한 배반포로 간주됩니다.

각 배반포는 유리화에 의해 개별적으로 동결되며 SCM(~8 μl)은 -800C에서 개별적으로 개별적으로 동결됩니다. 배아학자는 Gardner의 기준에 따라 최상의 형태를 기반으로 일련의 배반포 이식을 준비합니다.

그런 다음 배반포 동결 당일 PGT 실험실의 실험실 직원이 무작위 배정 프로그램을 사용하여 여성을 1:1 비율로 두 그룹으로 무작위 배정합니다.

1. 형태학 및 niPGT-A를 사용하는 개입 그룹 및
2. 형태학만을 기반으로 한 대조군.

여성과 임상의는 할당된 치료 그룹에 대해 눈이 멀게 됩니다. PGT 검사실의 검사실 직원만 그룹 배정을 알 수 있습니다.

사용된 배양 배지(SCM)의 niPGT-A 개입 그룹에서는 모든 SCM 샘플에서 회사의 권장 사항에 따라 NGS를 사용한 포괄적인 염색체 스크리닝을 수행합니다. 대조군에서는 첫 번째 이동에서 교체된 배반포의 SCM 샘플에서 소급하여 측정을 수행합니다. 모든 SCM 샘플은 향후 연구를 위해 저장됩니다.

상용 NI-PGT 키트(PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT 키트, PerkinElmer)를 사용하여 SCM 샘플을 분석합니다. 이 프로토콜은 이전에 전 세계 15개 실험실의 비침습적 샘플로 최적화되었습니다. 이 키트는 단일 튜브 워크플로, 전체 게놈에 대한 2단계 PCR을 따라 SCM에서 DNA를 증폭한 다음 인덱스 및 시퀀스별 어댑터를 템플릿 DNA에 연결하여 준비된 샘플을 시퀀싱합니다.

정제 후, 각 샘플의 농도를 등몰로 조정하고 풀링(샘플 96개)한 다음 MiSeq 시스템(Illumina)에서 1x75bp 판독 길이로 시퀀싱합니다. 온보드 2차 분석은 MiSeq Reporter(Illumina)에 이어 PG-Find 소프트웨어(v 1.0, PerkinElmer)에 의해 자동으로 수행되었습니다. 비정상적이고 구조화되지 않았으며 매우 반복적인 시퀀스에 정렬된 읽기는 분석에서 필터링됩니다. 1,000kb의 대상 bin 크기가 사용되며 최소 해상도는 10Mb입니다. 모든 게놈 위치는 인간 게놈 빌드 NCBI 37을 참조합니다.

PG-Find 소프트웨어의 기본 설정에 따라 이수성의 분류는 CNV(copy umber variation) 값에 의해 결정됩니다. CNV 값 >2.7은 이득으로 간주되고 CNV 값 <1.3은 손실로 간주됩니다. 하나 이상의 염색체가 이득/손실을 보일 때 샘플은 비정배수체로 결론을 내릴 것입니다.

SCM 샘플의 niPGT-A 보고서는 정배수체, 비정배수체 및 비정보적일 수 있습니다. 배아 이식 순서의 우선 순위를 지정하는 데만 사용됩니다. niPGT-A 보고서에서 정배수체가 아닌 배반포 결과는 폐기되지 않습니다.

맹검 배아학자는 위에 명시된 Gardner의 기준에 따라 배반포의 형태 등급을 매기고 IT 기술자가 관리할 온라인 데이터베이스에 배반포의 등급을 입력합니다. PGT 검사실의 검사실 직원은 NIPGT 결과가 나오면 PGT 결과를 로컬 데이터베이스에 입력합니다. IT 기술자는 PGT 검사실에서 데이터베이스를 수집하고 이를 온라인 소프트웨어에 입력하여 배반포 발생일(6일보다 5일이 더 좋음), 배반포 발생일에 따라 미리 결정된 알고리즘에 따라 배아 이식 순서를 컴파일합니다. 형태 및 niPGT-A 결과. IT 기술자는 배반포의 등급 및 NIPGT 결과에 대한 정보가 포함되지 않은 배아 이식 순서를 IVF 실험실의 배아학자에게 발행합니다. 따라서 모집된 피험자, 임상의 및 발생학자는 그룹 할당에 대해 눈이 멀게 됩니다.

niPGT-A의 예비 결과 진행 중인 NIPGT-A 시험의 예비 결과에는 1168 SCM이 포함되었습니다. 동시에 배양되었지만 배아와 접촉하지 않은 배지를 대조군(n=238)으로 수집했습니다. 증폭은 1158 SCM(99.1%, 1158/1168)에서 성공적이었고 1141 SCM에서 최종 결과(97.6%, 1141/1168)를 얻었다. 모든 컨트롤은 증폭을 나타내지 않았습니다.

냉동 배아 이식(FET) 배반포는 여성의 월경 주기가 규칙적인지 여부에 따라 후속 자연, 레트로졸 또는 호르몬 대체 주기에서 대체될 수 있습니다. 매번 하나의 배반포만 옮겨집니다. 대조군에서는 형태가 가장 좋은 배반포를 먼저 교체하고 배반포 이식 순서를 결정한 후 무작위 배정합니다. 개입 그룹에서는 niPGT-A 보고서를 사용할 수 있게 된 후 배반포 전달 순서가 수정되므로 최상의 형태 및 정배수체 결과를 가진 배반포가 먼저 교체됩니다.

임신 소변 임신 검사는 이송 후 14일에 시행됩니다. 임신 테스트 결과가 양성이면 2주 후에 경질 초음파를 시행하여 임신 위치를 파악하고 태아의 생존 능력과 태아 수를 확인합니다. 이후 관리는 다른 임신 초기 여성과 동일합니다. 진행 중인 임신이 8-10주일 때 산전 관리를 위해 의뢰될 것입니다.

후속 조치 임신 및 분만 데이터 검색에 관한 서면 동의는 불임으로 IVF를 위해 오는 모든 환자와 마찬가지로 연구 당시 여성에게서 구할 것입니다. 산모는 IVF 임신 후 일상적으로 임신 결과에 대한 정보를 검색하기 위해 출산 후 전화로 연락을 받게 됩니다. 임신 결과(분만, 유산), 태어난 아기 수, 출생 체중 및 산과 합병증이 기록됩니다.

첫 번째 FET에서 임신에 실패한 여성은 눈가림이 해제되고 가능한 경우 정배수체 배아가 교체됩니다. 정배수체 배아가 없는 경우 여성은 두 번째 IVF 주기를 선택할 수 있습니다.