Et randomiseret dobbeltblindet kontrolleret forsøg med niPGT-A hos kvinder med RPL (niPGTA)

Forsøgsmål og formål Det primære formål med dette randomiserede dobbeltblinde kontrollerede forsøg er at sammenligne effektiviteten i embryoselektion baseret på morfologi alene versus morfologi og niPGT-A hos kvinder med RPL, der gennemgår den første frosne embryooverførsel. De sekundære mål er at evaluere virkningen af ​​eNK-celler på abort og levende fødselsrater og forudsigelsen af ​​levende fødsel ved hjælp af spheroid/BAP-EB-tilknytningsassay.

De vigtigste hypoteser, der skal testes:

1. Embryonselektionen baseret på morfologi og niPGT-A for aneuploidi resulterer i en højere levende fødselsrate af IVF hos kvinder med RPL sammenlignet med kontrolgruppen baseret på morfologi alene.
2. Embryonselektionen baseret på morfologi og niPGT-A for aneuploidi resulterer i en lavere abortrate efter IVF hos kvinder med RPL sammenlignet med kontrolgruppen baseret på morfologi alene.

2. Forsøgsdesign Dette er et randomiseret dobbeltblindt kontrolleret forsøg. Kvalificerede kvinder vil blive rekrutteret til undersøgelsen, og informeret skriftligt samtykke vil blive indhentet efter rådgivning.

Endometrievurdering Alle kvinder vil få en endometriebiopsi ved hjælp af en Pipelle-prøvetager 7 dage efter luteiniserende hormonstigning (LH+7) forud for måneden for IVF. En del af endometrieprøverne vil blive fikseret i paraformaldehyd til immunhistokemisk farvning af endometriale uNK-celler med CD56-antistof [26,27]. Den anden del af endometrieprøverne vil blive brugt til epitel- og stromacelleisolering til spheroid/BAP-EB-bindingsassay [28], for at forudsige embryobindingshastigheden i et laboratoriemiljø. På grund af etiske spørgsmål og praktiske vanskeligheder er det ikke muligt at bruge menneskelige embryoner til endometrievurdering. BAP-EB model [28] vil blive brugt som embryo (blastocyst) surrogat i denne undersøgelse. BAP-EB-sfæroidmodellen er differentieret fra humane embryonale stamceller. BAP-EB efter 72 timers differentiering (BAP-EB-72h) har molekylær signatur af dag 7 trophectoderm celler fra blastocyster [28]. I denne undersøgelse vil BAP-EB blive dyrket sammen med primære endometriale epitelceller, og vedhæftningshastigheden vil blive bestemt i henhold til vores etablerede protokol.

IVF-protokol Kvinder vil gennemgå IVF med eller uden intracytoplasmatisk spermainjektion (ICSI) som angivet. Kvinderne vil modtage ovariestimulering ved hjælp af progestin-primet protokol [29] eller antagonistprotokollen. Ultralydsscanning vil blive arrangeret på dag 2-3 af menstruation for antral follikeltælling og for at udelukke tilstedeværelsen af ​​ovariecyster. Serum østradiol- og progesteronkoncentration vil blive kontrolleret, og hvis de er basale, gives ovariestimulation med gonadotropin-injektioner (225-300 IE dagligt afhængig af antralfollikeltal) i 10-12 dage. Provera 10 mg dagligt vil blive givet fra dag 2-3 til udløsningsdagen i den progestin-primede protokol for at forhindre for tidlig LH-stigning, mens GnRH-antagonist vil blive startet på dag 6 af ovariestimulering til dag for udløsning. Regelmæssig ultralydsovervågning vil blive udført for at overvåge væksten af ​​follikler. Justering af gonadotropindosis svarer til antallet og størrelsen af ​​follikler. Når tre follikler når >17 mm i diameter, vil GnRH-agonist (Decapeptyl 0,3 mg) eller humant choriongonadotropin (Ovidrel 0,25 mg) blive administreret. Oocytudhentning vil blive planlagt 34-36 timer efter HCG- eller agonist-triggeren under transvaginal ultralydsvejledning.

Normal befrugtning vil blive vurderet og bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​to pronuclei 16-18 timer efter insemination. Alle embryoner i spaltningsstadiet vil blive dyrket individuelt til blastocyststadiet, sædvanligvis dag 5 eller 6 efter oocytudvinding, i et monofasisk medium. På dag 3 vil dyrkningsmediet blive genopfyldt, og dyrkningen fortsættes ved 37oC og 6% CO2 i reduceret iltspænding (5%). Ingen ny overførsel af blastocyster vil blive udført i den stimulerede cyklus.

Gradering af blastocyst efter morfologi

Blastocyster klassificeres efter Gardners klassifikation (29). Blastocystklassificeringssystemet tildeler 3 separate kvalitetsscore til hvert blastocystembryon baseret på følgende:

1. Blastocystudviklingsstadiet: ekspansions- og udklækningsstatus
2. Indre cellemassescore
3. Trophectoderm score

Ekspansionsgrad Blastocystudvikling og stadiestatus

1. Blastocoel-hulrum mindre end halvdelen af ​​embryonets volumen
2. Blastocoel hulrum mere end halvdelen af ​​volumen af ​​embryonet
3. Fuld blastocyst, hulrum, der fylder embryoet fuldstændigt
4. Udvidet blastocyst, hulrum større end embryonet, med udtynding af zona pellucida
5. Klækning ud af zona pellucida
6. Udklækket fra zona pellucida

Indre cellemassekvalitet Indre cellemassekvalitet A Mange celler, tætpakket B Flere celler, løst grupperet C Meget få celler

Trophectoderm kvalitet Trophectoderm kvalitet A Mange celler, danner et sammenhængende lag B Få celler, danner et løst epitel C Meget få store celler

Blastocyster kryokonserveres på udviklingsstadiet med ekspansionsscore 3 eller derover. Hvis en blastocyst ikke når ekspansionsstadie 3 på dag 5, vil det på dag 6 blive vurderet, om den er egnet til kryokonservering. Blastocyster med enten indre cellemasse eller trophectoderm scoret som B eller højere betragtes som anvendelige blastocyster.

Hver blastocyst vil blive frosset ved forglasning individuelt, og dens SCM (~8 µl) vil blive frosset ved -800°C separat og individuelt. Embryologen vil forberede en sekvens af blastocystoverførsel baseret på den bedste morfologi efter Gardners kriterier.

Derefter vil kvinder på dagen for blastocystfrysning blive tilfældigt opdelt i to grupper i forholdet 1:1 ved hjælp af et randomiseringsprogram af laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet.

1. interventionsgruppen ved hjælp af morfologi og niPGT-A og
2. kontrolgruppen baseret på morfologi alene.

Kvinderne og klinikerne vil blive blindet over for de behandlingsgrupper, de er tildelt. Kun laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet vil være bekendt med gruppeopgaven.

niPGT-A af brugt kulturmedium (SCM) I interventionsgruppen vil der blive udført omfattende kromosomscreening ved brug af NGS i henhold til virksomhedens anbefalinger i alle SCM-prøver. I kontrolgruppen vil målingen blive foretaget retrospektivt i de SCM-prøver af blastocyster, der udskiftes ved den første overførsel. Alle SCM-prøver vil blive gemt til mulig fremtidig forskning.

Et kommercielt tilgængeligt NI-PGT-kit (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT-kit, PerkinElmer) vil blive brugt til at analysere SCM-prøver. Protokollen er tidligere blevet optimeret med ikke-invasive prøver fra 15 laboratorier rundt om i verden. Sættet følger et enkelt rørs workflow, to-trins PCR for at hele genomet amplificere DNA'et i SCM og derefter vedhæfte indekser og sekvensspecifikke adaptere til template DNA, hvilket resulterer i sekventeringsklare prøver.

Efter oprensning justeres koncentrationen af ​​hver prøve til lige store molarer, samles (96 prøver) og sekventeres derefter på et MiSeq-system (Illumina) ved 1 x 75 bp aflæst længde. Indbygget sekundær analyse blev udført automatisk af MiSeq Reporter (Illumina) efterfulgt af PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Læsninger, der tilpasser sig unormale, ustrukturerede og meget gentagne sekvenser, filtreres fra analysen. Der anvendes en målbeholderstørrelse på 1.000 kb, hvilket giver en minimumsopløsning på 10Mb. Alle genomiske positioner refererer til det humane genom opbygget NCBI 37.

I henhold til standardindstillingen af ​​PG-Find-softwaren bestemmes klassificering af aneuploidi af CNV-værdien (copy umber variation). CNV-værdi >2,7 betragtes som gevinst, mens CNV-værdi <1,3 betragtes som tab. Prøven konkluderes som ikke-euploid, når et eller flere af kromosomerne viser tilvækst/tab.

NiPGT-A-rapporten for SCM-prøven kan være euploid, ikke-euploid og ikke-informativ. Det bruges kun til at prioritere sekvensen af ​​embryooverførsel. Blastocyster med ikke-euploid resultat i niPGT-A-rapporten vil ikke blive kasseret.

Blindning Embryologen vil klassificere blastocysternes morfologi i henhold til Gardners kriterier ovenfor og indlæse klassificeringen af ​​blastocyster i en online database, som vil blive administreret af en IT-tekniker. Laboratoriepersonalet i PGT-laboratoriet vil indtaste PGT-resultatet i en lokal database, når NIPGT-resultaterne er tilgængelige. IT-teknikeren vil indsamle databasen fra PGT-laboratoriet og indtaste den i onlinesoftwaren for at kompilere sekvensen af ​​embryooverførsel i henhold til en forudbestemt algoritme, som afhænger af dagen for blastocystudvikling (dag 5 bedre end dag 6), blastocyst morfologi og niPGT-A resultat. IT-teknikeren vil udsende sekvensen for embryooverførsel, som ikke indeholder oplysninger om graderingen af ​​blastocysten og NIPGT-resultatet til embryologerne i IVF-laboratoriet. Derfor vil de rekrutterede forsøgspersoner, klinikerne og embryologerne være blinde for gruppetildelingen.

Vores foreløbige resultater af niPGT-A Foreløbige resultater af det igangværende NIPGT-A-forsøg involverede 1168 SCM. Medier dyrket parallelt, men uden kontakt med embryoner, blev opsamlet som kontroller (n=238). Amplifikation var vellykket i 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) og 1141 SCM resulterede i afgørende resultat (97,6%, 1141/1168). Alle kontroller viste ingen forstærkning.

Frozen embryo transfer (FET) Blastocyster kan erstattes i de efterfølgende naturlige, letrozol- eller hormonelle erstatningscyklusser, afhængigt af om kvinderne har regelmæssige menstruationscyklusser eller ej. Kun én blastocyst vil blive overført hver gang. I kontrolgruppen vil blastocyster med morfologi af bedste kvalitet blive erstattet først, og sekvensen af ​​blastocystoverførsel bestemmes forud for randomisering. I interventionsgruppen vil blastocyster med den bedste morfologi og bedste euploide resultat blive erstattet først, da sekvensen af ​​blastocystoverførsel vil blive ændret, efter at niPGT-A rapporterne er tilgængelige.

Graviditet Der vil blive udført en uringraviditetstest 14 dage efter overførslen. Hvis graviditetstesten er positiv, vil transvaginal ultralyd blive udført to uger senere for at lokalisere graviditeten og bekræfte fosterets levedygtighed og antallet af fostre. Den efterfølgende behandling vil være den samme som andre kvinder med tidlig graviditet. De vil blive henvist til svangerskabspleje, når den igangværende graviditet er 8-10 uger.

Opfølgning Der vil blive indhentet skriftligt samtykke vedrørende indhentning af graviditets- og fødselsdata fra kvinderne på undersøgelsestidspunktet, som for alle patienter, der kommer til IVF for infertilitet. Kvinderne vil efter fødslen blive kontaktet telefonisk for at få oplysninger om graviditetsudfald som rutine efter IVF-graviditet. Resultatet af graviditeten (fødsel, abort), antallet af fødte babyer, fødselsvægte og obstetriske komplikationer vil blive registreret.

Kvinder, der undlader at blive gravide i den første FET, vil blive afblindet, og et euploid embryo vil blive erstattet, hvis det er tilgængeligt. Hvis der ikke er et euploid embryo, kan kvinderne vælge at gennemgå den anden IVF-cyklus.