Un essai contrôlé randomisé en double aveugle de niPGT-A chez des femmes atteintes de RPL (niPGTA)

Objectifs et but de l'essai L'objectif principal de cet essai contrôlé randomisé en double aveugle est de comparer l'efficacité de la sélection d'embryons basée sur la morphologie seule par rapport à la morphologie et au niPGT-A chez les femmes atteintes de RPL subissant le premier transfert d'embryon congelé. Les objectifs secondaires sont d'évaluer l'impact des cellules eNK sur les taux de fausses couches et de naissances vivantes et la prédiction des naissances vivantes à l'aide du test d'attachement sphéroïde/BAP-EB.

Principales hypothèses à tester :

1. La sélection d'embryons basée sur la morphologie et le niPGT-A pour l'aneuploïdie entraîne un taux de naissances vivantes plus élevé de FIV chez les femmes atteintes de RPL par rapport au groupe témoin basé sur la morphologie seule.
2. La sélection d'embryons basée sur la morphologie et le niPGT-A pour l'aneuploïdie entraîne un taux de fausse couche inférieur après FIV chez les femmes atteintes de RPL par rapport au groupe témoin basé sur la morphologie seule.

2. Conception de l'essai Il s'agit d'un essai contrôlé randomisé en double aveugle. Les femmes éligibles seront recrutées pour l'étude et un consentement écrit éclairé sera obtenu après le conseil.

Évaluation de l'endomètre Toutes les femmes subiront une biopsie de l'endomètre à l'aide d'un échantillonneur Pipelle 7 jours après le pic d'hormone lutéinisante (LH + 7) avant le mois de la FIV. Une partie des échantillons d'endomètre sera fixée dans du paraformaldéhyde pour la coloration immunohistochimique des cellules uNK de l'endomètre avec l'anticorps CD56 [26,27]. L'autre partie des échantillons d'endomètre sera utilisée pour l'isolement des cellules épithéliales et stromales pour le test d'attachement sphéroïde/BAP-EB [28], afin de prédire le taux d'attachement de l'embryon en laboratoire. En raison de problèmes éthiques et de difficultés pratiques, l'utilisation d'embryons humains pour l'évaluation de l'endomètre n'est pas possible. Le modèle BAP-EB [28] sera utilisé comme substitut de l'embryon (blastocyste) dans cette étude. Le modèle de sphéroïde BAP-EB est différencié des cellules souches embryonnaires humaines. Les BAP-EB après 72h de différenciation (BAP-EB-72h) ont la signature moléculaire des cellules trophectodermiques du jour 7 des blastocystes [28]. Dans cette étude, BAP-EB sera co-cultivé avec des cellules épithéliales primaires de l'endomètre et le taux d'attachement sera déterminé selon notre protocole établi.

Protocole de FIV Les femmes subiront une FIV avec ou sans injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) selon les indications. Les femmes recevront une stimulation ovarienne selon le protocole progestatif [29] ou le protocole antagoniste. Une échographie sera organisée les 2e et 3e jours des règles pour le nombre de follicules antraux et pour exclure la présence d'un kyste ovarien. Les concentrations sériques d'œstradiol et de progestérone seront contrôlées et, si elles sont basales, une stimulation ovarienne avec des injections de gonadotrophine (225-300 UI par jour en fonction du nombre de follicules antraux) pendant 10 à 12 jours est administrée. Provera 10 mg par jour sera administré du jour 2-3 au jour du déclenchement dans le protocole amorcé par progestatif pour prévenir la poussée prématurée de LH tandis que l'antagoniste de la GnRH sera lancé du jour 6 de la stimulation ovarienne au jour du déclenchement. Une surveillance échographique régulière sera effectuée pour surveiller la croissance des follicules. L'ajustement de la posologie des gonadotrophines correspond au nombre et à la taille des follicules. Lorsque trois follicules atteignent > 17 mm de diamètre, un agoniste de la GnRH (Decapeptyl 0,3 mg) ou de la gonadotrophine chorionique humaine (Ovidrel 0,25 mg) sera administré. Le prélèvement d'ovocytes sera programmé 34 à 36 heures après le déclenchement de l'HCG ou de l'agoniste sous guidage échographique transvaginal.

La fécondation normale sera évaluée et confirmée par la présence de deux pronucléi à 16-18 h après l'insémination. Tous les embryons au stade de clivage seront cultivés individuellement jusqu'au stade de blastocyste, généralement 5 ou 6 jours après la récupération des ovocytes, dans un milieu monophasique. Au jour 3, le milieu de culture sera réapprovisionné et la culture se poursuivra à 37 oC et 6 % de CO2 dans une tension d'oxygène réduite (5 %). Aucun nouveau transfert de blastocystes ne sera effectué dans le cycle stimulé.

Classement du blastocyste par morphologie

Les blastocystes sont classés selon la classification de Gardner (29). Le système de classement des blastocystes attribue 3 scores de qualité distincts à chaque embryon de blastocyste, sur la base des éléments suivants :

1. Stade de développement du blastocyste : état d'expansion et d'éclosion
2. Score de masse cellulaire interne
3. Score Trophectoderme

Développement de blastocyste de grade d'expansion et statut de stade

1. Cavité blastocèle inférieure à la moitié du volume de l'embryon
2. Cavité blastocèle plus de la moitié du volume de l'embryon
3. Blastocyste complet, cavité remplissant complètement l'embryon
4. Blastocyste élargi, cavité plus grande que l'embryon, avec amincissement de la zone pellucide
5. Éclosion de la zone pellucide
6. Éclos de la zone pellucide

Qualité de la masse cellulaire interne Qualité de la masse cellulaire interne A Nombreuses cellules, serrées B Plusieurs cellules, regroupées de manière lâche C Très peu de cellules

Grade trophectoderme Qualité trophectoderme A Beaucoup de cellules, formant une couche cohésive B Peu de cellules, formant un épithélium lâche C Très peu de grosses cellules

Les blastocystes sont cryoconservés au stade de développement avec un score d'expansion de 3 ou plus. Si un blastocyste n'atteint pas le stade d'expansion 3 au jour 5, il sera évalué au jour 6 s'il convient à la cryoconservation. Les blastocystes avec une masse cellulaire interne ou un trophectoderme noté B ou plus sont considérés comme des blastocystes utilisables.

Chaque blastocyste sera congelé par vitrification individuellement et son SCM (~ 8 µl) sera congelé à -800C séparément et individuellement. L'embryologiste préparera une séquence de transfert de blastocyste basée sur la meilleure morphologie selon les critères de Gardner.

Ensuite, le jour de la congélation du blastocyste, les femmes seront ensuite réparties au hasard en deux groupes dans un rapport 1: 1 à l'aide d'un programme de randomisation par le personnel de laboratoire du laboratoire PGT.

1. le groupe d'intervention utilisant la morphologie et niPGT-A et
2. le groupe témoin basé sur la morphologie seule.

Les femmes et les cliniciens ne seront pas informés des groupes de traitement qui leur sont assignés. Seul le personnel de laboratoire du laboratoire PGT sera au courant de l'affectation de groupe.

niPGT-A du milieu de culture usé (SCM) Dans le groupe d'intervention, un dépistage chromosomique complet à l'aide de NGS sera effectué conformément aux recommandations de la société dans tous les échantillons de SCM. Dans le groupe témoin, la mesure sera effectuée rétrospectivement dans les échantillons SCM de blastocystes qui sont remplacés lors du premier transfert. Tous les échantillons de SCM seront sauvegardés pour d'éventuelles recherches futures.

Un kit NI-PGT disponible dans le commerce (kit PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT, PerkinElmer) sera utilisé pour analyser les échantillons de SCM. Le protocole a été précédemment optimisé avec des échantillons non invasifs provenant de 15 laboratoires du monde entier. Le kit suit un flux de travail à tube unique, une PCR en deux étapes pour amplifier l'ADN du génome entier dans le SCM, puis attache des index et des adaptateurs spécifiques à la séquence à l'ADN modèle, ce qui permet de séquencer des échantillons prêts.

Après purification, la concentration de chaque échantillon est ajustée en moles égales, regroupées (96 échantillons) puis séquencées sur un système MiSeq (Illumina) à une longueur de lecture de 1x75 pb. L'analyse secondaire intégrée a été effectuée automatiquement par le MiSeq Reporter (Illumina) suivi du logiciel PG-Find (v 1.0, PerkinElmer). Les lectures alignées sur des séquences anormales, non structurées et hautement répétitives sont filtrées de l'analyse. Une taille de bac cible de 1 000 Ko est utilisée, ce qui donne une résolution minimale de 10 Mo. Toutes les positions génomiques se réfèrent à la construction du génome humain NCBI 37.

Selon le réglage par défaut du logiciel PG-Find, la classification de l'aneuploïdie est déterminée par la valeur CNV (copy umber variation). La valeur CNV > 2,7 est considérée comme un gain tandis que la valeur CNV < 1,3 est considérée comme une perte. L'échantillon sera considéré comme non euploïde lorsqu'un ou plusieurs des chromosomes présentent un gain/une perte.

Le rapport niPGT-A de l'échantillon SCM peut être euploïde, non euploïde et non informatif. Il est utilisé uniquement pour prioriser la séquence de transfert d'embryons. Les blastocystes avec un résultat non euploïde dans le rapport niPGT-A ne seront pas rejetés.

Insu L'embryologiste notera la morphologie des blastocystes selon les critères de Gardner énoncés ci-dessus et entrera le classement des blastocystes dans une base de données en ligne, qui sera gérée par un technicien informatique. Le personnel de laboratoire du laboratoire PGT entrera le résultat PGT dans une base de données locale lorsque les résultats NIPGT seront disponibles. Le technicien informatique collectera la base de données du laboratoire PGT et l'entrera dans le logiciel en ligne pour compiler la séquence de transfert d'embryons selon un algorithme prédéterminé qui dépend du jour de développement du blastocyste (le jour 5 est meilleur que le jour 6), du blastocyste morphologie et résultat niPGT-A. Le technicien informatique délivrera la séquence de transfert d'embryons qui ne contient pas d'informations sur le classement du blastocyste et le résultat NIPGT aux embryologistes du laboratoire de FIV. Par conséquent, les sujets recrutés, les cliniciens et les embryologistes seront aveuglés à l'allocation de groupe.

Nos résultats préliminaires de niPGT-A Les résultats préliminaires de l'essai NIPGT-A en cours concernaient 1168 SCM. Des milieux cultivés en parallèle mais sans contact avec les embryons ont été collectés comme contrôles (n=238). L'amplification a réussi dans 1158 SCM (99,1 %, 1158/1168) et 1141 SCM a donné un résultat concluant (97,6 %, 1141/1168). Tous les contrôles n'ont montré aucune amplification.

Transfert d'embryon congelé (FET) Les blastocystes peuvent être remplacés dans les cycles de remplacement naturel, létrozole ou hormonal suivants, selon que les femmes ont ou non des cycles menstruels réguliers. Un seul blastocyste sera transféré à chaque fois. Dans le groupe témoin, les blastocystes avec la meilleure morphologie de qualité seront remplacés en premier et la séquence de transfert de blastocyste est décidée avant la randomisation. Dans le groupe d'intervention, les blastocystes avec la meilleure morphologie et le meilleur résultat euploïde seront remplacés en premier car la séquence de transfert de blastocyste sera modifiée une fois les rapports niPGT-A disponibles.

Grossesse Un test de grossesse urinaire sera effectué 14 jours après le transfert. Si le test de grossesse est positif, une échographie transvaginale sera effectuée deux semaines plus tard pour localiser la grossesse et confirmer la viabilité fœtale et le nombre de fœtus. La prise en charge ultérieure sera la même que pour les autres femmes ayant une grossesse précoce. Elles seront référées pour des soins prénatals lorsque la grossesse en cours aura atteint 8 à 10 semaines.

Suivi Un consentement écrit concernant la récupération des données de grossesse et d'accouchement sera demandé aux femmes au moment de l'étude comme chez tous les patients venant pour une FIV pour infertilité. Les femmes seront contactées après l'accouchement par téléphone pour récupérer les informations sur les résultats de la grossesse comme une routine après une grossesse par FIV. L'issue de la grossesse (accouchement, fausse couche), le nombre de bébés nés, les poids à la naissance et les complications obstétricales seront enregistrés.

Les femmes qui ne parviennent pas à tomber enceintes lors du premier FET seront levées en aveugle et un embryon euploïde sera remplacé s'il est disponible. S'il n'y a pas d'embryon euploïde, les femmes peuvent choisir de subir le deuxième cycle de FIV.