A niPGT-A randomizált kettős vak, kontrollált vizsgálata RPL-ben szenvedő nőknél (niPGTA)

A vizsgálat céljai és célja Ennek a randomizált kettős vak, kontrollos vizsgálatnak az elsődleges célja az embriószelekció hatékonyságának összehasonlítása pusztán a morfológia és a morfológia és az niPGT-A alapján az első fagyasztott embriótranszferen átesett RPL-ben szenvedő nőknél. A másodlagos cél az eNK sejtek vetélési és élveszületési arányra gyakorolt ​​hatásának értékelése, valamint az élveszületések előrejelzése szferoid/BAP-EB kötődési teszt segítségével.

A tesztelendő fő hipotézisek:

1. A morfológián és az aneuploidia niPGT-A-n alapuló embriószelekció az IVF-ben magasabb élveszületési arányt eredményez az RPL-ben szenvedő nőknél, mint a csak morfológia alapján végzett kontrollcsoport.
2. Az aneuploidia morfológiáján és niPGT-A-n alapuló embriószelekció alacsonyabb vetélési rátát eredményez az IVF-et követően RPL-ben szenvedő nőknél, mint a kontrollcsoport, amely önmagában a morfológia alapján történt.

2. Próbatervezés Ez egy randomizált, kettős vak, kontrollált vizsgálat. A vizsgálatra alkalmas nőket felvesznek, és a tanácsadást követően írásos beleegyezést kapnak.

Endometriális vizsgálat Minden nőnek endometrium biopsziája lesz Pipelle mintavevővel 7 nappal a luteinizáló hormon túlfeszültség (LH+7) után az IVF hónapja előtt. Az endometriumminták egy részét paraformaldehidben rögzítik az endometrium uNK-sejtek CD56 antitesttel történő immunhisztokémiai festésére [26,27]. Az endometriumminták másik részét hám- és stromasejtek izolálására használják szferoid/BAP-EB kötődési vizsgálathoz [28], hogy megjósolják az embriótapadási sebességet laboratóriumi körülmények között. Etikai kérdések és gyakorlati nehézségek miatt az emberi embriók méhnyálkahártya vizsgálatára való felhasználása nem kivitelezhető. Ebben a tanulmányban a BAP-EB modellt [28] embrió (blasztociszta) helyettesítőként használjuk. A BAP-EB szferoid modellt megkülönböztetik az emberi embrionális őssejtektől. A BAP-EB 72 órás differenciálódás után (BAP-EB-72h) a blasztociszták 7. napi trofektoderma sejtjeinek molekuláris aláírásával rendelkezik [28]. Ebben a vizsgálatban a BAP-EB-t az elsődleges méhnyálkahártya-hámsejtekkel együtt tenyésztjük, és a kötődési sebességet a kialakított protokollunk szerint határozzuk meg.

IVF-protokoll A nők IVF-en esnek át intracitoplazmatikus spermium injekcióval (ICSI) vagy anélkül, a jelzett módon. A nők petefészek-stimulációt kapnak a progesztin-primed protokoll [29] vagy az antagonista protokoll alkalmazásával. A menstruáció 2-3. napján ultrahangos vizsgálatra kerül sor az antrális tüszőszám megállapítására és a petefészek-ciszta jelenlétének kizárására. Ellenőrzik a szérum ösztradiol és progeszteron koncentrációját, és ha alapszintűek, petefészek-stimulációt végeznek gonadotropin injekcióval (225-300 NE naponta az antral tüszőszámtól függően) 10-12 napon keresztül. A Provera napi 10 mg-ot a 2-3. naptól a trigger napjáig adják a progesztin-primed protokollban a korai LH-hullám megelőzése érdekében, míg a GnRH-antagonistát a petefészek-stimuláció 6. napjától kezdik el kezdeni a trigger napjáig. A tüszők növekedésének nyomon követésére rendszeres ultrahangvizsgálatot kell végezni. A gonadotropin dózisának beállítása a tüszők számának és méretének megfelelően történik. Ha három tüsző eléri a 17 mm-nél nagyobb átmérőt, GnRH agonistát (Decapeptyl 0,3 mg) vagy humán koriongonadotropint (Ovidrel 0,25 mg) kell beadni. A petesejtek kinyerését a HCG vagy agonista trigger után 34-36 órával ütemezzük, transzvaginális ultrahangos irányítás mellett.

A normális megtermékenyülést a megtermékenyítést követő 16-18 órában két pronukleusz jelenléte értékeli és igazolja. Valamennyi hasítási stádiumú embriót külön-külön a blasztociszta stádiumig növesztjük, általában a petesejtek kinyerését követő 5. vagy 6. napon, egyfázisú tápközegben. A 3. napon a táptalajt feltöltjük, és a tenyésztést 37 oC-on és 6% CO2 mellett, csökkentett oxigénfeszültség mellett (5%) folytatjuk. A stimulált ciklusban nem kerül sor a blasztociszták új átvitelére.

A blasztociszták morfológiai osztályozása

A blasztocisztákat a Gardner-féle osztályozás (29) szerint osztályozzák. A blasztociszta-besorolási rendszer 3 külön minőségi pontszámot rendel minden egyes blasztociszta embrióhoz, a következők alapján:

1. Blastocysta fejlődési szakasz: expanzió és kikelés állapota
2. Belső sejttömeg pontszám
3. Trophectoderm pontszám

Expanziós fokozat Blastocysta fejlődése és állapota

1. A Blastocoel üreg kevesebb, mint az embrió térfogatának fele
2. A Blastocoel üreg az embrió térfogatának több mint fele
3. Teljes blasztociszta, az üreg teljesen kitölti az embriót
4. Kitágult blasztociszta, az embriónál nagyobb üreg, a zona pellucida elvékonyodásával
5. Kikel a zona pellucida
6. Kikelt a zona pellucida-ból

Belső sejttömeg-osztály Belső sejttömeg-minőség A Sok sejt, szorosan összetömörítve B Több sejt, lazán csoportosítva C Nagyon kevés sejt

Trophectoderm minőség Trophectoderm minőség A Sok sejt, összefüggő réteget alkot B Kevés sejt, laza hámot képez C Nagyon kevés nagy sejt

A blastocisztákat a fejlődési szakaszban 3-as vagy magasabb expanziós pontszámmal mélyhűtve tárolják. Ha egy blasztociszta nem éri el a 3. expanziós stádiumot az 5. napon, akkor a 6. napon megvizsgálják, hogy alkalmas-e krioprezervációra. A belső sejttömeggel vagy trofektodermával rendelkező blasztocisztákat B vagy afölötti minősítéssel rendelkező blasztociszták hasznosítható blasztocisztáknak tekintik.

Minden blasztocisztát külön-külön üvegezéssel fagyasztanak le, az SCM-jét (~8 µl) pedig -800 C-on külön-külön és egyenként is lefagyasztják. Az embriológus elkészíti a blasztociszta transzfer szekvenciáját a Gardner-kritériumok szerinti legjobb morfológia alapján.

Ezután a blasztociszta lefagyasztásának napján a nőket véletlenszerűen két csoportba osztják 1:1 arányban a PGT laboratórium laboratóriumi személyzete által végzett randomizációs program segítségével.

1. a morfológiát és niPGT-A-t alkalmazó intervenciós csoport és
2. a kontrollcsoport kizárólag a morfológia alapján.

A nők és a klinikusok vakok lesznek a számukra kijelölt kezelési csoportokra. A csoportbeosztásról csak a PGT laboratóriumában dolgozó laboratóriumi személyzet tud majd.

Elhasznált táptalaj (SCM) niPGT-A Az intervenciós csoportban a cég ajánlásai szerint NGS-sel átfogó kromoszómaszűrést végeznek minden SCM mintában. A kontrollcsoportban a mérést visszamenőlegesen végzik el azokban a blasztociszták SCM-mintáiban, amelyeket az első transzfer során kicseréltek. Az összes SCM mintát elmentjük az esetleges jövőbeni kutatásokhoz.

A kereskedelemben kapható NI-PGT készletet (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT kit, PerkinElmer) fogják használni az SCM minták elemzéséhez. A protokollt korábban a világ 15 laboratóriumából származó non-invazív mintákkal optimalizálták. A készlet egyetlen csöves munkafolyamatot, kétlépéses PCR-t követ, hogy a teljes genom amplifikálja a DNS-t az SCM-ben, majd indexeket és szekvencia-specifikus adaptereket csatol a templát DNS-hez, ami kész minták szekvenálását eredményezi.

Tisztítás után az egyes minták koncentrációját egyenlő molárisra állítjuk, összegyűjtjük (96 minta), majd MiSeq rendszeren (Illumina) 1x75 bp leolvasási hosszon szekvenáljuk. A fedélzeti másodlagos elemzést automatikusan a MiSeq Reporter (Illumina), majd a PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer) hajtotta végre. Az anomális, strukturálatlan és erősen ismétlődő szekvenciákhoz igazodó leolvasásokat kiszűrjük az elemzésből. A cél 1000 kb méretű tárat használnak, ami 10 Mb minimális felbontást biztosít. Minden genomi pozíció az emberi genom felépítésére utal, az NCBI 37.

A PG-Find szoftver alapértelmezett beállításai szerint az aneuploidia besorolását a CNV (copy umber variation) érték határozza meg. A 2,7 feletti CNV érték nyereségnek, míg az 1,3 alatti CNV érték veszteségnek minősül. A minta nem euploidnak minősül, ha egy vagy több kromoszóma növekedést/vesztést mutat.

Az SCM minta niPGT-A jelentése lehet euploid, nem euploid és nem informatív. Csak az embriótranszfer szekvenciájának prioritási meghatározására szolgál. A niPGT-A jelentésben nem euploid eredménnyel rendelkező blasztocisztákat a rendszer nem dobja el.

Vakítás Az embriológus a fenti Gardner-kritériumok szerint osztályozza a blasztociszták morfológiáját, és beírja a blasztociszták osztályozását egy online adatbázisba, amelyet egy informatikus kezel. A PGT laboratóriumában dolgozó laboratóriumi személyzet a PGT eredményt egy helyi adatbázisba viszi be, amikor a NIPGT eredményei rendelkezésre állnak. Az informatikus összegyűjti az adatbázist a PGT laboratóriumból, és beírja az online szoftverbe, hogy egy előre meghatározott algoritmus szerint összeállítsa az embrióátültetés sorrendjét, amely a blasztociszta kialakulásának napjától függ (az 5. nap jobb, mint a 6. nap), blastocysta morfológia és niPGT-A eredmény. Az informatikus az embriótranszfer szekvenciáját, amely nem tartalmaz információt a blasztociszta minősítéséről és a NIPGT eredményről, kiadja az IVF laboratórium embriológusainak. Ezért a felvett alanyok, a klinikusok és az embriológusok vakok lesznek a csoportok elosztására.

Az niPGT-A előzetes eredményei A folyamatban lévő NIPGT-A vizsgálat előzetes eredményei 1168 SCM-et érintettek. Kontrollként párhuzamosan tenyésztett, de embriókkal nem érintkező tápközeget gyűjtöttünk (n=238). Az amplifikáció sikeres volt 1158 SCM-ben (99,1%, 1158/1168), és 1141 SCM-ben döntő eredményt (97,6%, 1141/1168) eredményezett. Minden kontroll nem mutatott erősítést.

Fagyasztott embriótranszfer (FET) A blasztociszták a következő természetes, letrozol- vagy hormonpótlási ciklusban pótolhatók, attól függően, hogy a nők menstruációs ciklusa rendszeres-e vagy sem. Minden alkalommal csak egy blasztociszta kerül átadásra. A kontrollcsoportban először a legjobb minőségű morfológiájú blasztocisztákat cserélik ki, és a randomizálás előtt döntik el a blasztociszta transzfer sorrendjét. Az intervenciós csoportban először a legjobb morfológiájú és euploid eredménnyel rendelkező blasztocisztákat cserélik le, mivel a blasztociszta transzfer szekvenciája módosul, miután az niPGT-A jelentések rendelkezésre állnak.

Terhesség Az átültetés után 14 nappal vizeletben terhességi tesztet kell végezni. Ha a terhességi teszt pozitív, két héttel később transzvaginális ultrahangot végeznek a terhesség megállapítására, valamint a magzat életképességének és a magzatok számának megerősítésére. A későbbi kezelés ugyanúgy történik, mint más korai terhességben szenvedő nőknél. Terhesgondozásra utalják, ha a terhesség 8-10 hetes.

Nyomon követés A terhességi és szülési adatok lekéréséhez a nőktől írásos hozzájárulást kell kérni a vizsgálat időpontjában, mint minden meddőség miatt IVF-re érkező betegnél. A szülés után telefonon felveszik a kapcsolatot a nőkkel, hogy az IVF terhesség után rutinszerűen lekérjék a terhesség kimenetelére vonatkozó információkat. Rögzítésre kerül a terhesség kimenetele (szülés, vetélés), a megszületett babák száma, a születési súly és a szülészeti szövődmények.

Azokat a nőket, akiknek nem sikerült teherbe esnie az első FET-ben, megszabadítják a vaktól, és ha rendelkezésre áll, euploid embriót cserélnek ki. Ha nincs euploid embrió, a nők választhatják a második IVF ciklust.