Satunnaistettu kaksoissokkokontrolloitu niPGT-A-koe naisilla, joilla on RPL (niPGTA)

Tutkimuksen tavoitteet ja tarkoitus Tämän satunnaistetun kaksoissokkoutetun kontrolloidun tutkimuksen ensisijainen tavoite on verrata tehoa alkioiden valinnassa pelkästään morfologiaan verrattuna morfologiaan ja niPGT-A:han naisilla, joilla on RPL ja joille tehdään ensimmäinen pakastealkionsiirto. Toissijaisina tavoitteina on arvioida eNK-solujen vaikutusta keskenmenoon ja elävänä syntyvyyden määrään sekä elävänä syntymän ennustaminen sferoidi/BAP-EB-kiinnitysmäärityksellä.

Tärkeimmät testattavat hypoteesit:

1. Morfologiaan ja niPGT-A:han perustuva alkion valinta aneuploidiaan johtaa korkeampaan IVF-syntyvyyteen naisilla, joilla on RPL, verrattuna pelkkään morfologiaan perustuvaan kontrolliryhmään.
2. Morfologiaan ja niPGT-A:han perustuva alkion valinta aneuploidiaan johtaa pienempään keskenmenoon IVF:n jälkeen naisilla, joilla on RPL, verrattuna kontrolliryhmään, joka perustuu pelkästään morfologiaan.

2. Kokeen suunnittelu Tämä on satunnaistettu kaksoissokkokontrolloitu koe. Tutkimuskelpoiset naiset rekrytoidaan tutkimukseen ja tietoinen kirjallinen suostumus hankitaan neuvonnan jälkeen.

Kohdun limakalvon arviointi Kaikille naisille tehdään kohdun limakalvon biopsia Pipellen näytteenottimella 7 päivää luteinisoivan hormonin nousun (LH+7) jälkeen ennen IVF-kuukautta. Osa kohdun limakalvonäytteistä kiinnitetään paraformaldehydissä kohdun limakalvon uNK-solujen immunohistokemiallista värjäystä varten CD56-vasta-aineella [26,27]. Toista osaa kohdun limakalvonäytteistä käytetään epiteelisolujen ja stroomasolujen eristämiseen sferoidi/BAP-EB-kiinnitysmäärityksessä [28], jotta voidaan ennustaa alkion kiinnittymisnopeus laboratorio-olosuhteissa. Eettisistä syistä ja käytännön vaikeuksista johtuen ihmisalkioiden käyttö kohdun limakalvon arvioinnissa ei ole mahdollista. BAP-EB-mallia [28] käytetään alkion (blastokystan) korvikkeena tässä tutkimuksessa. BAP-EB sferoidimallit erotetaan ihmisen alkion kantasoluista. BAP-EB:llä 72 tunnin erilaistumisen jälkeen (BAP-EB-72h) on blastokystien 7. päivän trofektodermisolujen molekyylitunnus [28]. Tässä tutkimuksessa BAP-EB:tä viljellään yhdessä primaaristen endometriumin epiteelisolujen kanssa ja kiinnittymisnopeus määritetään vakiintuneen protokollamme mukaisesti.

IVF-protokolla Naisille tehdään IVF joko intrasytoplasmisella siittiöinjektiolla (ICSI) tai ilman sitä ohjeiden mukaisesti. Naiset saavat munasarjojen stimulaatiota käyttämällä progestiinipohjaista protokollaa [29] tai antagonistiprotokollaa. Ultraäänitutkimus järjestetään kuukautisten 2.-3. päivänä anturaalisten follikkelien lukumäärän ja munasarjakystojen poissulkemiseksi. Seerumin estradioli- ja progesteronipitoisuudet tarkistetaan, ja jos ne ovat perustason, munasarjojen stimulaatiota annetaan gonadotropiiniinjektioilla (225-300 IU päivässä antralirakkuloiden määrästä riippuen) 10-12 päivän ajan. Provera 10 mg päivittäin annetaan päivästä 2–3 laukaisupäivään progestiinivalmisteisessa protokollassa ennenaikaisen LH-huippujen estämiseksi, kun taas GnRH-antagonisti aloitetaan munasarjojen stimulaation 6. päivänä laukaisupäivään. Säännöllinen ultraäänitutkimus suoritetaan follikkelien kasvun seuraamiseksi. Gonadotropiinin annoksen säätäminen vastaa follikkelien määrää ja kokoa. Kun kolmen follikkelin halkaisija saavuttaa > 17 mm, annetaan GnRH-agonistia (Decapeptyl 0,3 mg) tai ihmisen koriongonadotropiinia (Ovidrel 0,25 mg). Munasolujen haku ajoitetaan 34–36 tunnin kuluttua HCG:n tai agonistin laukaisemisesta transvaginaalisen ultraääniohjauksen alaisena.

Normaali hedelmöitys arvioidaan ja vahvistetaan kahden esituman läsnäololla 16-18 tuntia inseminoinnin jälkeen. Kaikki katkaisuvaiheen alkiot kasvatetaan yksitellen blastokystivaiheeseen, yleensä 5. tai 6. päivänä munasolun talteenoton jälkeen, yksifaasisessa alustassa. Päivänä 3 viljelyalusta täytetään ja viljelyä jatketaan 37 oC:ssa ja 6 % CO2:ssa alennetussa happipaineessa (5 %). Stimuloidussa syklissä ei suoriteta uutta blastokystien siirtoa.

Blastokystin luokittelu morfologian mukaan

Blastokystat luokitellaan Gardnerin luokituksen (29) mukaan. Blastokysta-luokitusjärjestelmä antaa 3 erillistä laatupistettä kullekin blastokystialkiolle seuraavien seikkojen perusteella:

1. Blastokystin kehitysvaihe: laajenemis- ja kuoriutumistila
2. Sisäsolumassapisteet
3. Trophectoderm pisteet

Laajennusluokka Blastocyst kehitys ja vaiheen tila

1. Blastocoel-ontelo alle puolet alkion tilavuudesta
2. Blastocoel-ontelo yli puolet alkion tilavuudesta
3. Täysi blastokysta, onkalo täyttää alkion kokonaan
4. Laajentunut blastokysta, onkalo suurempi kuin alkio, ja zona pellucida ohenee
5. Kuoriutuu ulos zona pellucidasta
6. Kuoriutui ulos zona pellucidasta

Sisäinen solumassaluokka Sisäisen solumassan laatu A Paljon soluja, tiiviisti pakattu B Useita soluja, löyhästi ryhmitelty C Hyvin vähän soluja

Trophectoderm laatu Trophectoderm laatu A Monet solut, jotka muodostavat yhtenäisen kerroksen B Harvat solut muodostavat löysän epiteelin C Hyvin harvat suuret solut

Blastokystit kylmäsäilytetään kehitysvaiheessa laajenemispistemäärällä 3 tai enemmän. Jos blastokysta ei saavuta laajentumisvaihetta 3 päivänä 5, päivänä 6 arvioidaan, soveltuuko se kylmäsäilytykseen. Blastokystit, joilla on joko sisäinen solumassa tai trofektoderma, joiden pistemäärä on B tai korkeampi, katsotaan käyttökelpoisiksi blastokysteiksi.

Jokainen blastokysti jäädytetään lasittamalla yksitellen ja sen SCM (~8 µl) jäädytetään -800 C:een erikseen ja yksittäin. Embryologi valmistelee blastokystan siirtosekvenssin Gardnerin kriteerien mukaan parhaan morfologian perusteella.

Sitten blastokystan jäädytyspäivänä naiset jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään suhteessa 1:1 käyttäen satunnaistusohjelmaa PGT-laboratorion laboratorion henkilökunnan toimesta.

1. interventioryhmä käyttäen morfologiaa ja niPGT-A:ta ja
2. vertailuryhmä perustuu pelkästään morfologiaan.

Naiset ja lääkärit sokeutuvat heille määrätyille hoitoryhmille. Vain PGT-laboratorion laboratorion henkilökunta on tietoinen ryhmätehtävästä.

Käytetyn elatusaineen niPGT-A (SCM) Interventioryhmässä tehdään kattava kromosomiseulonta NGS:llä yrityksen suositusten mukaisesti kaikissa SCM-näytteissä. Kontrolliryhmässä mittaus tehdään takautuvasti niissä SCM-näytteissä blastokysta, jotka korvataan ensimmäisessä siirrossa. Kaikki SCM-näytteet tallennetaan mahdollista tulevaa tutkimusta varten.

SCM-näytteiden analysointiin käytetään kaupallisesti saatavaa NI-PGT-sarjaa (PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT Kit, PerkinElmer). Protokolla on aiemmin optimoitu ei-invasiivisilla näytteillä 15 laboratoriosta ympäri maailmaa. Kitti seuraa yhden putken työnkulkua, kaksivaiheista PCR:ää koko genomin DNA:n monistamiseksi SCM:ssä ja liittää sitten indeksit ja sekvenssispesifiset adapterit templaatti-DNA:han, mikä johtaa valmiiden näytteiden sekvensointiin.

Puhdistuksen jälkeen kunkin näytteen pitoisuus säädetään yhtä suureksi molaariseksi, yhdistetään (96 näytettä) ja sekvensoidaan sitten MiSeq-järjestelmällä (Illumina) lukupituudella 1 x 75 bp. Sisäinen toissijainen analyysi suoritti automaattisesti MiSeq Reporter (Illumina) ja sen jälkeen PG-Find Software (v 1.0, PerkinElmer). Lukemat, jotka kohdistuvat poikkeaviin, rakenteellisiin ja erittäin toistuviin sekvensseihin, suodatetaan analyysistä. Käytetään 1 000 kb:n tavoitelokeroa, joka antaa vähintään 10 Mb resoluution. Kaikki genomiset paikat viittaavat ihmisen genomin rakenteeseen NCBI 37.

PG-Find-ohjelmiston oletusasetuksen mukaan aneuploidian luokittelu määräytyy CNV-arvon (copy umber variation) mukaan. CNV-arvo > 2,7 katsotaan voitoksi, kun taas CNV-arvo <1,3 katsotaan tappioksi. Näyte päätetään ei-euploidiseksi, kun yksi tai useampi kromosomeista osoittaa vahvistusta/häviötä.

SCM-näytteen niPGT-A-raportti voi olla euploidinen, ei-euploidinen ja ei-informatiivinen. Sitä käytetään vain priorisoimaan alkionsiirtojärjestys. Blastokystit, joiden tulos ei ole euploidinen niPGT-A-raportissa, ei hylätä.

Sokkoutus Embryologi arvioi blastokystien morfologian Gardnerin edellä mainittujen kriteerien mukaisesti ja syöttää blastokystien luokituksen online-tietokantaan, jota hallinnoi IT-teknikko. PGT-laboratorion laboratorion henkilökunta syöttää PGT-tuloksen paikalliseen tietokantaan, kun NIPGT-tulokset ovat saatavilla. IT-teknikko kerää tietokannan PGT-laboratoriosta ja syöttää sen online-ohjelmistoon alkionsiirtojärjestyksen laatimiseksi ennalta määrätyn algoritmin mukaan, joka riippuu blastokystan kehittymispäivästä (päivä 5 parempi kuin päivä 6), blastokysta morfologia ja niPGT-A-tulos. IT-teknikko antaa alkionsiirtojärjestyksen, joka ei sisällä tietoa blastokystan luokittelusta ja NIPGT-tuloksesta, IVF-laboratorion embryologeille. Siksi rekrytoidut koehenkilöt, lääkärit ja embryologit sokeutuvat ryhmien jakamiseen.

Alustavat tulokset niPGT-A:sta Meneillään olevan NIPGT-A-tutkimuksen alustavat tulokset sisälsivät 1168 SCM:ää. Elatusaineet, joita viljeltiin rinnakkain, mutta ilman kosketusta alkioiden kanssa, kerättiin kontrolleiksi (n = 238). Amplifikaatio onnistui 1158 SCM:ssä (99,1%, 1158/1168) ja 1141 SCM:ssä johti ratkaisevaan tulokseen (97,6%, 1141/1168). Kaikki kontrollit eivät osoittaneet vahvistusta.

Frozen embryo transfer (FET) Blastokystat voidaan korvata myöhemmissä luonnollisissa, letrotsoli- tai hormonaalisissa korvausjaksoissa riippuen siitä, ovatko naiset säännölliset kuukautiskierrot vai eivät. Vain yksi blastokysta siirretään joka kerta. Vertailuryhmässä korvataan ensin morfologialtaan laadukkaimman blastokystit ja blastokystien siirtojärjestys päätetään ennen satunnaistamista. Interventioryhmässä blastokystit, joilla on paras morfologia ja euploidinen tulos, korvataan ensin, koska blastokystien siirtojärjestystä muutetaan sen jälkeen, kun niPGT-A-raportit ovat saatavilla.

Raskaus Virtsaraskaustesti tehdään 14 päivän kuluttua siirrosta. Jos raskaustesti on positiivinen, transvaginaalinen ultraääni tehdään kahden viikon kuluttua raskauden paikantamiseksi ja sikiön elinkelpoisuuden ja sikiöiden lukumäärän vahvistamiseksi. Myöhempi hoito on sama kuin muut naiset, joilla on varhainen raskaus. Heidät lähetetään synnytyshoitoon, kun raskaus on 8-10 viikkoa.

Seuranta Naisilta pyydetään kirjallinen suostumus raskaus- ja synnytystietojen hakemiseen tutkimuksen aikana, kuten kaikilta hedelmättömyyden vuoksi IVF-hoitoon tulevilta potilailta. Naisiin ollaan yhteydessä synnytyksen jälkeen puhelimitse tiedon saamiseksi raskauden tuloksista rutiinina IVF-raskauden jälkeen. Kirjataan raskauden lopputulos (synnytys, keskenmeno), syntyneiden vauvojen lukumäärä, syntymäpainot ja synnytyskomplikaatiot.

Naiset, jotka eivät tule raskaaksi ensimmäisessä FET:ssä, sokkoutetaan ja euploidinen alkio korvataan, jos mahdollista. Jos euploidista alkiota ei ole, naiset voivat valita toisen IVF-syklin.