Randomizowana podwójnie ślepa, kontrolowana próba niPGT-A u kobiet z RPL (niPGTA)

Cele i cel badania Głównym celem tego randomizowanego, podwójnie ślepego, kontrolowanego badania jest porównanie skuteczności selekcji zarodków na podstawie samej morfologii w porównaniu z morfologią i niPGT-A u kobiet z RPL poddawanych pierwszemu transferowi zamrożonych zarodków. Do drugorzędnych celów należy ocena wpływu komórek eNK na odsetek poronień i żywych urodzeń oraz przewidywanie żywych urodzeń przy użyciu testu przylegania sferoidy/BAP-EB.

Główne hipotezy do sprawdzenia:

1. Selekcja zarodków oparta na morfologii i niPGT-A pod kątem aneuploidii skutkuje wyższym wskaźnikiem żywych urodzeń IVF u kobiet z RPL w porównaniu z grupą kontrolną na podstawie samej morfologii.
2. Selekcja zarodków oparta na morfologii i niPGT-A pod kątem aneuploidii skutkuje niższym odsetkiem poronień po IVF u kobiet z RPL w porównaniu z grupą kontrolną opartą wyłącznie na morfologii.

2. Projekt badania Jest to randomizowana, podwójnie ślepa, kontrolowana próba. Kwalifikujące się kobiety zostaną zrekrutowane do badania, a świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana po poradnictwie.

Ocena endometrium Wszystkie kobiety zostaną poddane biopsji endometrium przy użyciu próbnika Pipelle 7 dni po gwałtownym wzroście hormonu luteinizującego (LH+7) przed miesiącem IVF. Część próbek endometrium zostanie utrwalona w paraformaldehydzie do immunohistochemicznego barwienia endometrialnych komórek uNK przeciwciałem CD56 [26,27]. Pozostała część próbek endometrium zostanie wykorzystana do izolacji komórek nabłonka i zrębu do testu przyczepności sferoidy/BAP-EB [28], aby przewidzieć szybkość przyczepu zarodka w warunkach laboratoryjnych. Ze względów etycznych i trudności praktycznych wykorzystanie embrionów ludzkich do oceny endometrium jest niewykonalne. Model BAP-EB [28] zostanie wykorzystany jako substytut zarodka (blastocysty) w tym badaniu. Sferoidalny model BAP-EB różni się od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. BAP-EB po 72h różnicowania (BAP-EB-72h) posiadają sygnaturę molekularną komórek trofektodermy dnia 7 blastocyst [28]. W tym badaniu BAP-EB będzie hodowany razem z pierwotnymi komórkami nabłonka endometrium, a stopień przylegania zostanie określony zgodnie z naszym ustalonym protokołem.

Protokół IVF Kobiety zostaną poddane IVF z lub bez docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika (ICSI), zgodnie ze wskazaniami. Kobiety otrzymają stymulację jajników przy użyciu protokołu z progestagenem [29] lub protokołu z antagonistą. Badanie ultrasonograficzne zostanie przeprowadzone w 2-3 dniu miesiączki w celu oceny liczby pęcherzyków antralnych i wykluczenia obecności torbieli jajnika. Oznaczone zostaną stężenia estradiolu i progesteronu w surowicy i jeśli są podstawowe, zostanie podana stymulacja jajników zastrzykami z gonadotropin (225-300 IU dziennie w zależności od liczby pęcherzyków antralnych) przez 10-12 dni. Provera 10 mg dziennie będzie podawana od dnia 2-3 do dnia wyzwalania w protokole z progestagenem, aby zapobiec przedwczesnemu wzrostowi LH, podczas gdy antagonista GnRH zostanie rozpoczęty w dniu 6 stymulacji jajników do dnia wyzwalania. Regularne monitorowanie ultrasonograficzne będzie wykonywane w celu monitorowania wzrostu pęcherzyków. Dostosowanie dawki gonadotropin do liczby i wielkości pęcherzyków. Gdy trzy pęcherzyki osiągną średnicę >17 mm, zostanie podany agonista GnRH (Decapeptyl 0,3 mg) lub ludzka gonadotropina kosmówkowa (Ovidrel 0,25 mg). Pobranie oocytów zostanie zaplanowane 34-36 godzin po aktywacji HCG lub agonisty pod kontrolą USG przezpochwowego.

Prawidłowe zapłodnienie zostanie ocenione i potwierdzone przez obecność dwóch przedjądrzy w 16-18 h po inseminacji. Wszystkie zarodki w fazie rozszczepienia będą hodowane indywidualnie do stadium blastocysty, zwykle 5 lub 6 dnia po pobraniu oocytów, w pożywce jednofazowej. W dniu 3 pożywka hodowlana zostanie uzupełniona i hodowla będzie kontynuowana w temperaturze 37oC i 6% CO2 w obniżonym ciśnieniu tlenu (5%). W cyklu stymulacji nie zostanie wykonany świeży transfer blastocyst.

Klasyfikacja blastocysty według morfologii

Blastocysty klasyfikuje się według klasyfikacji Gardnera (29). System klasyfikacji blastocysty przypisuje każdemu zarodkowi blastocysty 3 oddzielne oceny jakości na podstawie następujących kryteriów:

1. Etap rozwoju blastocysty: stan ekspansji i wylęgu
2. Wynik masy komórek wewnętrznych
3. Wynik Trophektodermy

Stopień ekspansji Rozwój blastocysty i status stadium

1. Jama blastocelowa mniejsza niż połowa objętości zarodka
2. Wnęka blastocelu większa niż połowa objętości zarodka
3. Pełna blastocysta, jama całkowicie wypełniająca zarodek
4. Rozrośnięta blastocysta, jama większa niż zarodek, ze ścieńczeniem warstwy przejrzystej
5. Wylęganie się z zona pellucida
6. Wykluł się z zona pellucida

Stopień masy komórek wewnętrznych Jakość masy komórek wewnętrznych A Wiele komórek, ciasno upakowane B Kilka komórek, luźno pogrupowanych C Bardzo mało komórek

Trophectoderm grade Trophectoderm quality A Wiele komórek tworzących spójną warstwę B Niewiele komórek tworzących luźny nabłonek C Bardzo mało dużych komórek

Blastocysty są kriokonserwowane na etapie rozwoju z oceną ekspansji 3 lub wyższą. Jeżeli blastocysta nie osiągnie 3. stadium ekspansji w 5. dniu, w 6. dniu zostanie ocenione, czy nadaje się do kriokonserwacji. Blastocysty z wewnętrzną masą komórkową lub trofektodermą ocenioną jako B lub wyższą uważa się za nadające się do wykorzystania blastocysty.

Każda blastocysta zostanie zamrożona indywidualnie przez witryfikację, a jej SCM (~8 µl) zostanie zamrożona w temperaturze -80°C oddzielnie i indywidualnie. Embriolog przygotuje sekwencję transferu blastocysty w oparciu o najlepszą morfologię według kryteriów Gardnera.

Następnie, w dniu zamrożenia blastocysty, kobiety zostaną losowo przydzielone do dwóch grup w stosunku 1:1 przy użyciu programu randomizacji przez pracowników laboratorium w laboratorium PGT.

1. grupa interwencyjna wykorzystująca morfologię i niPGT-A i
2. grupa kontrolna oparta wyłącznie na morfologii.

Kobiety i klinicyści będą ślepi na przydzielone im grupy terapeutyczne. Tylko pracownicy laboratorium w laboratorium PGT będą świadomi przydziału grupowego.

niPGT-A zużytej pożywki hodowlanej (SCM) W grupie interwencyjnej, zgodnie z zaleceniami firmy, we wszystkich próbkach SCM zostanie przeprowadzone kompleksowe badanie przesiewowe chromosomów przy użyciu NGS. W grupie kontrolnej pomiar zostanie wykonany retrospektywnie w tych próbkach SCM blastocyst, które są wymieniane w pierwszym transferze. Wszystkie próbki SCM zostaną zapisane do ewentualnych przyszłych badań.

Do analizy próbek SCM zostanie użyty dostępny w handlu zestaw NI-PGT (zestaw PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT, PerkinElmer). Protokół został wcześniej zoptymalizowany przy użyciu nieinwazyjnych próbek z 15 laboratoriów na całym świecie. Zestaw jest zgodny z przepływem pracy z pojedynczą probówką, dwuetapowym PCR w celu amplifikacji całego genomu w SCM, a następnie dołącza indeksy i specyficzne dla sekwencji adaptery do matrycy DNA, co skutkuje sekwencjonowaniem gotowych próbek.

Po oczyszczeniu stężenie każdej próbki doprowadza się do równych molowych, łączy (96 próbek), a następnie sekwencjonuje w systemie MiSeq (Illumina) przy długości odczytu 1x75 bp. Pokładowa analiza wtórna została przeprowadzona automatycznie przez MiSeq Reporter (Illumina), a następnie oprogramowanie PG-Find (v 1.0, PerkinElmer). Odczyty pasujące do anomalnych, nieustrukturyzowanych i wysoce powtarzalnych sekwencji są filtrowane z analizy. Używany jest docelowy rozmiar pojemnika 1000 kb, co daje minimalną rozdzielczość 10 Mb. Wszystkie pozycje genomowe odnoszą się do budowy ludzkiego genomu NCBI 37.

Zgodnie z domyślnymi ustawieniami oprogramowania PG-Find, klasyfikacja aneuploidii jest określana na podstawie wartości CNV (copy umbvari). Wartość CNV >2,7 uważa się za zysk, a wartość CNV <1,3 za stratę. Próbka zostanie uznana za nieeuploidalną, gdy jeden lub więcej chromosomów wykazuje wzmocnienie/utratę.

Raport niPGT-A próbki SCM może być euploidalny, nieeuploidalny i nieinformacyjny. Jest on używany wyłącznie do nadania priorytetu sekwencji transferu zarodków. Blastocysty z wynikiem nieeuploidalnym w raporcie niPGT-A nie zostaną odrzucone.

Zaślepienie Embriolog oceni morfologię blastocyst zgodnie z podanymi powyżej kryteriami Gardnera i wprowadzi ocenę blastocyst do internetowej bazy danych, którą będzie zarządzał technik IT. Personel laboratorium w laboratorium PGT wprowadzi wynik PGT do lokalnej bazy danych, gdy wyniki NIPGT będą dostępne. Informatyk pobierze bazę danych z laboratorium PGT i wprowadzi ją do oprogramowania online w celu zestawienia kolejności transferu zarodków według wcześniej ustalonego algorytmu, który zależy od dnia rozwoju blastocysty (dzień 5 lepszy niż dzień 6), blastocysty morfologia i wynik niPGT-A. Technik IT wyda sekwencję transferu zarodków, która nie zawiera informacji o stopniu zaawansowania blastocysty i wyniku NIPGT embriologom w pracowni IVF. Dlatego rekrutowani pacjenci, klinicyści i embriolodzy nie będą świadomi przydziału do grup.

Nasze wstępne wyniki niPGT-A Wstępne wyniki trwającego badania NIPGT-A objęły 1168 SCM. Pożywki hodowane równolegle, ale bez kontaktu z zarodkami, zebrano jako kontrole (n=238). Amplifikacja była skuteczna w 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) i 1141 SCM dała rozstrzygający wynik (97,6%, 1141/1168). Wszystkie kontrole nie wykazały amplifikacji.

Transfer zamrożonych zarodków (FET) Blastocysty mogą być zastępowane w kolejnych naturalnych, letrozolowych lub hormonalnych cyklach zastępczych, w zależności od tego, czy kobiety mają regularne cykle miesiączkowe, czy też nie. Za każdym razem przenoszona będzie tylko jedna blastocysta. W grupie kontrolnej blastocysty o najlepszej morfologii zostaną zastąpione w pierwszej kolejności, a kolejność transferu blastocyst zostanie ustalona przed randomizacją. W grupie interwencyjnej blastocysty o najlepszym wyniku morfologicznym i euploidalnym zostaną zastąpione w pierwszej kolejności, ponieważ sekwencja transferu blastocyst zostanie zmodyfikowana po udostępnieniu raportów niPGT-A.

Ciąża Test ciążowy z moczu zostanie wykonany 14 dni po transferze. Jeśli wynik testu ciążowego jest pozytywny, po dwóch tygodniach zostanie wykonane USG przezpochwowe w celu zlokalizowania ciąży i potwierdzenia żywotności płodu oraz liczby płodów. Dalsze postępowanie będzie takie samo jak w przypadku innych kobiet we wczesnej ciąży. Zostaną skierowane na opiekę przedporodową, gdy ciąża trwa 8-10 tygodni.

Kontynuacja Pisemna zgoda na uzyskanie danych dotyczących ciąży i porodu będzie wymagana od kobiet w czasie badania, podobnie jak w przypadku wszystkich pacjentek zgłaszających się na IVF z powodu niepłodności. Po porodzie skontaktujemy się z kobietami telefonicznie w celu uzyskania informacji o wynikach ciąży, rutynowo po ciąży IVF. Wynik ciąży (poród, poronienie), liczba urodzonych dzieci, waga urodzeniowa i powikłania położnicze zostaną odnotowane.

Kobiety, które nie zajdą w ciążę w pierwszym FET, zostaną odślepione, a euploidalny zarodek zostanie zastąpiony, jeśli będzie dostępny. Jeśli nie ma euploidalnego zarodka, kobiety mogą zdecydować się na drugi cykl IVF.