Um estudo randomizado duplo-cego controlado de niPGT-A em mulheres com RPL (niPGTA)

Objetivos e finalidade do estudo O objetivo principal deste estudo randomizado duplo-cego controlado é comparar a eficácia na seleção de embriões com base apenas na morfologia versus morfologia e niPGT-A em mulheres com RPL submetidas à primeira transferência de embriões congelados. Os objetivos secundários são avaliar o impacto das células eNK nas taxas de aborto espontâneo e nascidos vivos e a previsão de nascidos vivos usando o ensaio de fixação de esferoide/BAP-EB.

Principais hipóteses a serem testadas:

1. A seleção de embriões com base na morfologia e niPGT-A para aneuploidia resulta em uma maior taxa de nascidos vivos de fertilização in vitro em mulheres com RPL em comparação com o grupo de controle com base apenas na morfologia.
2. A seleção de embriões com base na morfologia e niPGT-A para aneuploidia resulta em uma menor taxa de aborto após fertilização in vitro em mulheres com RPL em comparação com o grupo de controle com base apenas na morfologia.

2. Desenho do estudo Este é um estudo randomizado duplo-cego controlado. As mulheres elegíveis serão recrutadas para o estudo e o consentimento informado por escrito será obtido após o aconselhamento.

Avaliação endometrial Todas as mulheres farão uma biópsia endometrial usando um amostrador Pipelle 7 dias após o aumento do hormônio luteinizante (LH+7) antes do mês da fertilização in vitro. Parte das amostras endometriais será fixada em paraformaldeído para coloração imuno-histoquímica de células uNK endometriais com anticorpo CD56 [26,27]. A outra parte das amostras endometriais será usada para isolamento de células epiteliais e estromais para ensaio de fixação de esferóide/BAP-EB [28], para prever a taxa de fixação do embrião em um ambiente de laboratório. Devido a questões éticas e dificuldades práticas, o uso de embriões humanos para avaliação endometrial não é viável. O modelo BAP-EB [28] será usado como substituto do embrião (blastocisto) neste estudo. O modelo de esferoide BAP-EB é diferenciado de células-tronco embrionárias humanas. Os BAP-EB após 72h de diferenciação (BAP-EB-72h) apresentam assinatura molecular de células trofectodermáticas de dia 7 de blastocistos [28]. Neste estudo, BAP-EB será co-cultivado com células epiteliais endometriais primárias e a taxa de adesão será determinada de acordo com nosso protocolo estabelecido.

Protocolo de fertilização in vitro As mulheres serão submetidas à fertilização in vitro com ou sem injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), conforme indicado. As mulheres receberão estimulação ovariana usando o protocolo de progestina [29] ou o protocolo antagonista. A ultrassonografia será realizada no dia 2-3 da menstruação para a contagem de folículos antrais e para excluir a presença de cisto ovariano. A concentração sérica de estradiol e progesterona será verificada e, se forem basais, será administrada estimulação ovariana com injeções de gonadotrofina (225-300 UI diariamente, dependendo da contagem de folículos antrais) por 10 a 12 dias. Provera 10 mg por dia será administrado do dia 2-3 ao dia do gatilho no protocolo de progestina para prevenir o pico prematuro de LH, enquanto o antagonista de GnRH será iniciado no dia 6 da estimulação ovariana até o dia do gatilho. O monitoramento regular por ultrassom será realizado para monitorar o crescimento dos folículos. O ajuste da dosagem de gonadotrofina é correspondente ao número e tamanho dos folículos. Quando três folículos atingirem >17 mm de diâmetro, será administrado agonista de GnRH (Decapeptyl 0,3mg) ou gonadotrofina coriônica humana (Ovidrel 0,25mg). A coleta de oócitos será agendada 34-36 horas após o HCG ou o gatilho do agonista sob orientação de ultrassom transvaginal.

A fertilização normal será avaliada e confirmada pela presença de dois pronúcleos 16-18 h após a inseminação. Todos os embriões em estágio de clivagem serão cultivados individualmente até o estágio de blastocisto, geralmente no dia 5 ou 6 após a recuperação do oócito, em meio monofásico. No dia 3, o meio de cultura será reabastecido e a cultura será continuada a 37oC e 6% de CO2 em tensão reduzida de oxigênio (5%). Nenhuma transferência recente de blastocistos será realizada no ciclo estimulado.

Classificação do blastocisto por morfologia

Os blastocistos são classificados de acordo com a classificação de Gardner (29). O sistema de classificação de blastocisto atribui 3 pontuações de qualidade separadas para cada embrião de blastocisto, com base no seguinte:

1. Estágio de desenvolvimento do blastocisto: status de expansão e eclosão
2. Pontuação de massa celular interna
3. Pontuação do trofectoderma

Grau de expansão Desenvolvimento do blastocisto e status do estágio

1. Cavidade da blastocele com menos da metade do volume do embrião
2. Cavidade da blastocele com mais da metade do volume do embrião
3. Blastocisto completo, cavidade preenchendo completamente o embrião
4. Blastocisto expandido, cavidade maior que o embrião, com afinamento da zona pelúcida
5. Eclosão da zona pelúcida
6. Eclodido fora da zona pelúcida

Grau de massa celular interna Qualidade da massa celular interna A Muitas células, bem compactadas B Várias células, frouxamente agrupadas C Muito poucas células

Grau Trofectoderme Qualidade Trofectoderme A Muitas células, formando uma camada coesa B Poucas células, formando um epitélio frouxo C Muito poucas células grandes

Os blastocistos são criopreservados no estágio de desenvolvimento com pontuação de expansão 3 ou superior. Se um blastocisto não atingir o estágio de expansão 3 no dia 5, será avaliado no dia 6 se é adequado para criopreservação. Blastocistos com massa celular interna ou trofectoderme classificados como B ou acima são considerados blastocistos utilizáveis.

Cada blastocisto será congelado por vitrificação individualmente e seu SCM (~8 µl) será congelado a -800C separadamente e individualmente. O embriologista preparará uma sequência de transferência de blastocisto com base na melhor morfologia pelos critérios de Gardner.

Então, no dia do congelamento do blastocisto, as mulheres serão divididas aleatoriamente em dois grupos na proporção de 1:1 usando um programa de randomização pela equipe do laboratório do PGT.

1. o grupo de intervenção usando morfologia e niPGT-A e
2. o grupo de controle com base apenas na morfologia.

As mulheres e os médicos serão cegos para os grupos de tratamento aos quais foram designados. Somente a equipe do laboratório do PGT estará ciente da atribuição do grupo.

niPGT-A do meio de cultura gasto (SCM) No grupo de intervenção, a triagem cromossômica abrangente usando NGS será realizada de acordo com as recomendações da empresa em todas as amostras de SCM. No grupo controle, a medição será feita retrospectivamente naquelas amostras de SCM de blastocistos que são substituídos na primeira transferência. Todas as amostras de SCM serão salvas para possíveis pesquisas futuras.

Um kit NI-PGT disponível comercialmente (kit PG-Seq Rapid Non-Invasive PGT, PerkinElmer) será usado para analisar amostras de SCM. O protocolo foi previamente otimizado com amostras não invasivas de 15 laboratórios ao redor do mundo. O kit segue um fluxo de trabalho de tubo único, PCR de duas etapas para todo o genoma amplificar o DNA no SCM e, em seguida, anexar índices e adaptadores específicos de sequência ao DNA modelo, resultando em amostras prontas para sequenciamento.

Após a purificação, a concentração de cada amostra é ajustada em molar igual, agrupada (96 amostras) e então sequenciada em um sistema MiSeq (Illumina) em 1x75 pb de comprimento de leitura. A análise secundária integrada foi realizada automaticamente pelo MiSeq Reporter (Illumina) seguido pelo software PG-Find (v 1.0, PerkinElmer). Leituras alinhadas a sequências anômalas, não estruturadas e altamente repetitivas são filtradas da análise. Um tamanho de compartimento de destino de 1.000 kb é usado, fornecendo uma resolução mínima de 10 Mb. Todas as posições genômicas referem-se à construção do genoma humano NCBI 37.

De acordo com a configuração padrão do software PG-Find, a classificação da aneuploidia é determinada pelo valor CNV (variação do número de cópia). O valor de CNV >2,7 é considerado ganho, enquanto o valor de CNV <1,3 é considerado perda. A amostra será considerada não euploide quando um ou mais dos cromossomos apresentar ganho/perda.

O relatório niPGT-A da amostra SCM pode ser euploide, não euploide e não informativo. É usado apenas para priorizar a sequência de transferência de embriões. Blastocistos com resultado não euploide no laudo niPGT-A não serão descartados.

Cegueira O embriologista classificará a morfologia dos blastocistos de acordo com os critérios de Gardner descritos acima e inserirá a classificação dos blastocistos em um banco de dados online, que será gerenciado por um técnico de TI. A equipe do laboratório do PGT inserirá o resultado do PGT em um banco de dados local quando os resultados do NIPGT estiverem disponíveis. O técnico de informática coletará o banco de dados do laboratório PGT e o inserirá no software online para compilar a sequência de transferência de embriões de acordo com um algoritmo pré-determinado que depende do dia de desenvolvimento do blastocisto (dia 5 melhor que dia 6), blastocisto morfologia e resultado niPGT-A. O técnico de informática emitirá a sequência de transferência de embriões que não contém informações sobre a graduação do blastocisto e o resultado do NIPGT para os embriologistas do laboratório de fertilização in vitro. Portanto, os indivíduos recrutados, os clínicos e os embriologistas serão cegos para a alocação do grupo.

Nossos resultados preliminares do niPGT-A Os resultados preliminares do estudo NIPGT-A em andamento envolveram 1168 SCM. Meios cultivados em paralelo, mas sem contato com embriões, foram coletados como controle (n=238). A amplificação foi bem-sucedida em 1158 SCM (99,1%, 1158/1168) e 1141 SCM resultou em resultado conclusivo (97,6%, 1141/1168). Todos os controles não apresentaram amplificação.

Transferência de embriões congelados (FET) Os blastocistos podem ser substituídos nos ciclos subsequentes naturais, de letrozol ou de reposição hormonal, dependendo se as mulheres têm ciclos menstruais regulares ou não. Apenas um blastocisto será transferido de cada vez. No grupo de controle, os blastocistos com a morfologia de melhor qualidade serão substituídos primeiro e a sequência de transferência do blastocisto é decidida antes da randomização. No grupo de intervenção, os blastocistos com a melhor morfologia e resultado euploide serão substituídos primeiro, pois a sequência de transferência do blastocisto será modificada depois que os relatórios niPGT-A estiverem disponíveis.

Gravidez Um teste de gravidez de urina será realizado 14 dias após a transferência. Se o teste de gravidez for positivo, uma ultrassonografia transvaginal será realizada duas semanas depois para localizar a gravidez e confirmar a viabilidade fetal e o número de fetos. O manejo subsequente será o mesmo de outras mulheres com gravidez precoce. Elas serão encaminhadas para cuidados pré-natais quando a gravidez em andamento estiver entre 8 e 10 semanas.

Acompanhamento O consentimento por escrito referente à recuperação dos dados da gravidez e do parto será solicitado às mulheres no momento do estudo, assim como em todos os pacientes que vêm para fertilização in vitro por infertilidade. As mulheres serão contatadas após o parto por telefone para recuperar as informações dos resultados da gravidez como rotina após a gravidez de fertilização in vitro. O resultado da gravidez (parto, aborto espontâneo), número de bebês nascidos, peso ao nascer e complicações obstétricas serão registrados.

As mulheres que não conseguirem engravidar no primeiro FET serão reveladas e um embrião euploide será substituído, se disponível. Se não houver embrião euploide, as mulheres podem optar por se submeter ao segundo ciclo de fertilização in vitro.