肺への入り口としての咳の捕捉 (CC1)

仮説: 咳は、肺における DNA やタンパク質などの大きな分子の有効な非侵襲的代用物として機能し、さまざまな臨床および公衆衛生の目的に使用できる可能性があります。

提案の概要: 肺深部から独自に捕捉された高分子の疫学的かつ臨床応用可能なプラットフォームの開発に向けて、研究チームは咳嗽の収集、および肺深部の咳嗽検体を分割する有効性と実用性のテストを含む新しいアプローチを追求する予定です。特定の細胞外小胞（EV）。 この咳検体は、すべて同じ個人からの侵襲的に収集された深部肺サンプル BAL/気管支ブラッシングからの検体、および潜在的に汚染されている洗口液と比較されます。 研究チームはまず、これらの粗咳嗽標本、次にEV分割気道標本を、Vijg/Maslov研究室で開発された最先端技術である体細胞変異用のSMMバルクシークエンシングと、特異的であることが知られているタンパク質によって体細胞変異について検査することを提案している。 Sidoli/プロテオミクスコアでは、口腔/唾液ではなく肺の場合に使用されます。

具体的な目的:

1. 5人の健康なボランティアと5人の現在の喫煙者において、うがい薬とBALと並行して、エアロチャンバーまたは同等/最適化された装置によって咳が捕捉されます。 これらの同じサンプルからの深部肺捕捉 (Loudig lab) による肺特異的 EV が並行して実行されます。
2. 咳は、単一分子変異シーケンス (SMM-seq) を使用して DNA 変異解析を受けます。
3. 咳止め、うがい薬、BAL は、当社の中核施設で LC-MS を使用してプロテオミクス分析を受けます。

アプローチ：

ヒト肺研究プロトコルの実践一般: 継続的な被験者登録は、長年 IRB によって承認されたアインシュタイン・モンテフィオーレ臨床症例対照プロトコル (2007-407) の一部です。 登録資格のある呼吸器診療所の個人は次のとおりです: 年齢 > 21 歳、何らかの喫煙状況、BAL の禁忌を除く無数の併存疾患があり、日常ケアの一環として臨床的に適応のある肺採取手技 (気管支鏡検査) を予定している人。 これは、年間 100 ～ 150 人を超える気管支鏡検査および関連する元喫煙者のドナーを採用することになります。 150～200を超えるそのような既存の気管支鏡サンプルセット、および付随する非侵襲的EBC、およびMW、頬側ブラシなどが保管されており、現在の研究に利用できる可能性がある。 すべてのデータ/検体は診断前および処置前に収集されます。各被験者は、気管支鏡検査の前に EBC (および咳などの他の非侵襲性物質) サンプルを提供します。 したがって、このアクティブなプロトコルは、(i) リコールバイアスを最小限に抑えます。 (ii) これらの肺処置に特有の肺組織の破壊および流出による非侵襲性検体の汚染。 最新の診断/検査を収集し、症例管理の誤分類を最小限に抑えるために、各被験者は医療記録で 3 か月間追跡調査されます。 広範な人口統計、曝露および臨床データが利用可能です。(1) 人口統計情報。 (2) 喫煙の詳細: (3) 基礎疾患のマーカー: (4) 既存の画像検査 (5) 臨床情報/病理学的所見。 この ICTR パイロットの場合:

1. 目的 1: 気管支鏡検査を受ける前に、健康なボランティア 5 名と現在喫煙している 5 名の咳を採取します。 研究用の BAL および洗口液の検体も収集されます。 深部肺捕捉（Loudig lab）によるこれらのサンプルからの肺特異的EVは並行して実行されます。

咳はエアロチャンバー（喘息計用量吸入器/ポンプ用の一般的な使い捨てハンドヘルドスペーサーデバイス）で捕捉されます。 研究チームは、これが適切な咳（強制呼気）捕捉装置であることを発見しましたが、さらなる最適化が保留されています。 計画されている修正案では、患者は手持ち式プラスチックチャンバー内で合計 10 分間、30 秒ごとに咳をするように指示されます。 次に、チャンバー全体のすべての内面を 2 ～ 4 ml の PBS でリンスし、リンス/洗浄液を急速冷凍します。 その後、すすぎ液は、研究対象の分析物に応じて処理されます。 DNA の場合、イソプロパノール/EtOH 沈殿ステップがあり、その後少量で再懸濁し、Qiagen/Zymo DNA 単離キットで抽出します。 タンパク質の場合、PBS 中の粗抽出物は、沈殿、乾燥、バッファーへの再懸濁、ショットガン分析用の LC-MS プラットフォームへの注入によってコア内で直接処理されます。

EV 分割手順が公開されています。 EV-CATCHER™ は、目的の細胞タイプに特有の固有の表面膜タンパク質をターゲットにして、細胞特異的な EV を直接捕捉するようにカスタマイズできます。 Loudig研究室は、例えば、深部肺細胞の固有かつ特異的なタンパク質（例えば、Clara細胞特異的タンパク質（CCSP）、肺胞2型細胞界面活性剤タンパク質-C（SFTPC））を標的とする抗体を使用すると、EVを特異的に精製できることを実証する広範なデータをまとめました。気管支肺胞洗浄液 (BAL) および呼気凝縮液 (EBC) から分析し、同様の miRNA 発現プロファイルを取得します。 最後に、固定化プラットフォーム (ポリスチレン 96 ウェル プレート) と活性化抗体の間に酵素分解可能なウラシル化二本鎖ビオチン標識 DNA リンカーを追加することにより、ウラシル グリコシラーゼ (UNG) とのインキュベーションによる免疫精製された EV の無傷の放出を促進できます。

アプローチ: 咳、洗口液、および BAL サンプルを提供する 10 人の初期ドナーからのアリコート (現在喫煙者 5 人、非喫煙者 5 人)、EV 分割用のすべてのサンプル タイプのうち合計 30 個の初期サンプル。 次に、分割されていない全体サンプルと EV 分割されたサンプルの両方が生成され (合計 60 個のサンプル)、2 つの主要なアッセイ (以下の体細胞突然変異の SMM とショットガン プロテオミクス) にトリアージされます。両方とも実現可能性の実証と、動物の代理出産のパイロット評価を目的としています。肺の咳。

目的 2: SMM を使用して咳の DNA 変異解析を行います。 正常細胞におけるゲノム配列の完全性を直接分析します。 正常なヒト組織におけるゲノム配列の完全性を研究する際の重要な問題は、ゲノムにおける DNA 変異のランダムな性質です。 一部の突然変異はクローン的に増幅されますが、大部分は各細胞に固有であり、したがって稀であり、変異体であるため、単一細胞の全ゲノム増幅または in vitro クローン増幅アッセイのいずれかが必要です。 どちらのアプローチもアーティファクトに関連しています。 最近、Maslov/Vijg 研究室は、単一細胞またはクローン増幅された単一細胞の体細胞変異を定量的に評価するための信頼できる方法を開発しました。 これらの方法を使用して、近位気管支上皮基底細胞における塩基置換突然変異が喫煙（および加齢）とともに増加することが証明された。 体細胞変異の定量分析のための新しい方法である単一分子変異シーケンス (SMM-seq) は、はるかにコスト効率が高く、少量のバルク DNA に適用できます。 この最新の SMM-seq 法は、とりわけ、細胞学的に正常な細胞の変異を正確に検出する実用的な手段を可能にするため、重要です。

アプローチ: 20 個の咳サンプル (未分画 10 個、分画済み 10 個) は、プロトコールに記載されているように DNA 抽出、ライブラリーの調製および配列決定を受けます。 検出されたすべての変異体間の体細胞突然変異は、同じ個人の DNA から通常の配列決定ライブラリーの分析によって見つかった生殖系列多型を差し引くことによって発生します。 体細胞バリアントの数は、呼び出し可能な塩基、つまり、SMM-seq ライブラリーでは 7 倍を超えるカバレッジを持ち、通常のライブラリーでは 20 倍を超えるカバレッジを持つ塩基の数に正規化されます。 体細胞突然変異の頻度は、ゲノムあたりの突然変異の数として表されます。 残りの 40 サンプル（うがい薬から 20 サンプル、BAL から 20 サンプル）は、予算上の制約を考慮して、他の進行中の資金調達メカニズムの下で処理されます。

目的 3: 咳、うがい薬、および BAL は、アインシュタインの中核施設で LC-MS を使用してプロテオミクス分析を受けます。 おそらく、存在量が少ない物質の技術的限界のため、咳嗽におけるこれまでのプロテオミクスの試みは研究チームの知る限り存在しない。 プロテオミクス コア (Sidoli ら) は、存在量の少ないタンパク質/ペプチドの定量化の感度と速度を向上させる戦略を最適化します。 サンプル前処理プロトコルは、サンプルの損失を最小限に抑え、最先端の MS と組み合わせたナノ液体クロマトグラフィーを小型化して、BAL、MW、および EBC 標本のタンパク質/ペプチドを定量するように変更されます。

アプローチ: プロテオミクス用のサンプル調製: 咳嗽検体を完全に乾燥させた後、標準プロテオミクスサンプル調製 (トリプシン 20 ng) のために 50 mM 重炭酸アンモニウム (pH = 8) 5 μL に再懸濁します。 次に、Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) 質量分析計とオンラインで接続された Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) ナノ液体クロマトグラフィーを使用して、サンプル全体を分析します。 分離には、研究室では最小内径 (内径 50 μm、長さ 25 cm) の社内充填分析カラムを利用し、流量約 100 nL/min の分子を分離できるようにします。 流速が低いため、カラムから溶出するサンプルの前濃縮が強化され、サブアトモルの感度が得られます。

その後、Sidoli ラボのパイプラインを使用して、データ変換を含むデータ分析が実行されます。 簡単に説明すると、プロテオミクス MS スペクトルは、Proteome Discoverer (v2.5、Thermo Scientific) を使用して、誤検出率についてコミュニティによって現在推奨されているしきい値よりも厳しいしきい値 (スペクトルの一致、ペプチド、およびタンパク質の FDR が 1% 未満) を使用して識別および定量化されます。 その後、Sidoli lab の説明に従って、定量的な値が変換および正規化されます。 統計的規制は、パラメトリック統計を使用して評価されます (p< 0.05)。 候補のリストが比較的短いため、クロマトグラムは手動で検査されます。

すべての咳サンプル (未分画 10 個、分画 10 個 x 3 種類の検体 = 60 個のサンプル) は、記載されているプロテオミクス分析を受けます。

コンパートメント間比較: 肺の咳嗽代理の決定は、肺の EBC 代理の場合と同様の方法で実行できます。 特定のプラットフォーム内で、SMM 変異のレベル (およびシグネチャ) が比較されます。 最近では、呼気中のマイクロRNA環境（ここでは提案されていない）において、これは、主成分におけるマイクロRNA-seqデータクラスタリングのスピアマン相関、PCA（図示せず）およびスピアマン相関（図示せず）によって実行されている。 プロテオミクス環境では、クラスタリング ヒートマップ、PCA、およびスピアマン相関などの方法によって、肺の咳のこの代理を咳についても同様に示すことができます。

結果: 新しいプラットフォーム生体標本としての咳のこの最初のパイロットテストは、ハイリスクでハイリターンの実用的な翻訳作業です。 このパイロットプロジェクトが、調査した2つのプラットフォームで咳が肺の有効な代替品であることを示した場合、それはさらなる連邦資金提供を支援するための強力な予備的証拠を提供することになる。 気道をベースとした肺への入り口のこの可能性は、急性および慢性の臨床および公衆衛生の幅広い目的で想定される可能性があります。