Hoestvangst als poort naar de long (CC1)

Hypothese: Hoest kan dienen als een geldig niet-invasief surrogaat voor de long voor grote moleculen zoals DNA en eiwitten, mogelijk voor een verscheidenheid aan klinische en volksgezondheidsdoeleinden.

Kort voorstel: Voor de ontwikkeling van een epidemiologisch en klinisch toepasbaar platform voor grote moleculen die op unieke wijze uit de diepe long worden opgevangen, zal het onderzoeksteam een ​​nieuwe aanpak nastreven die hoestverzameling omvat en het testen van de werkzaamheid en bruikbaarheid van het opdelen van hoestmonsters voor diepe longen. specifieke extracellulaire blaasjes (EV's). Dit hoestmonster zal worden vergeleken met dat van invasief verzamelde diepe longmonsters, BAL/bronchiale poetsbeurten, en met de mogelijk verontreinigende mondspoeling, allemaal van dezelfde personen. Het onderzoeksteam stelt in eerste instantie voor om deze ruwe hoestspecimens, en vervolgens EV-gepartitioneerde luchtwegmonsters, te onderzoeken op somatische mutaties door middel van SMM-bulksequencing op somatische mutaties, geavanceerde technieken ontwikkeld in de Vijg/Maslov-laboratoria en op eiwitten waarvan bekend is dat ze specifiek zijn. voor de longen, in tegenstelling tot de mondholte/speeksel, in de kern van Sidoli/proteomics.

Specifieke doelstellingen:

1. Bij 5 gezonde vrijwilligers en bij 5 huidige rokers wordt de hoest opgevangen door een aerochamber of gelijkwaardig/geoptimaliseerd apparaat, parallel met mondspoeling en met BAL. Longspecifieke EV's van dezelfde monsters via diepe longopname (Loudig lab) zullen parallel worden uitgevoerd.
2. Hoest zal DNA-mutatieanalyses ondergaan met behulp van Single Molecule Mutation Sequencing (SMM-seq).
3. Hoest, mondwater en BAL ondergaan proteomische analyse met behulp van LC-MS in onze Core-faciliteit.

Benadering:

Protocolpraktijken bij menselijke longstudies in het algemeen: voortdurende inschrijving van proefpersonen maakt deel uit van een al lang bestaand IRB-goedgekeurd Einstein-Montefiore klinisch patiëntcontroleprotocol (2007-407). Personen uit longklinieken die in aanmerking komen voor inschrijving zijn: leeftijd > 21 jaar, elke rookstatus, talloze comorbide status behalve contra-indicaties voor BAL, gepland voor klinisch geïndiceerde longverzamelingsprocedure (bronchoscopie) als onderdeel van routinematige zorg. Dit komt neer op >100-150 rekruteringen van bronchoscopie en aanverwante voormalige rokersdonoren per jaar. Meer dan 150-200 van dergelijke reeds bestaande bronchoscopische monstersets en bijbehorende niet-invasieve EBC, samen met MW, buccale borstel, andere] zijn opgeslagen en mogelijk beschikbaar voor de huidige studie. Alle gegevens/specimens worden vóór diagnose en pre-procedure verzameld; elk onderwerp levert EBC-monsters (en andere niet-invasieve middelen zoals hoest) pre-bronchoscopie. Als zodanig minimaliseert dit actieve protocol (i) recall bias; en (ii) besmetting van niet-invasieve specimens door de verstoringen en het morsen van het longweefsel dat inherent is aan deze longprocedures. Elke proefpersoon zal gedurende 3 maanden in het medisch dossier worden gevolgd om bijgewerkte diagnostiek/testen te verzamelen en misclassificatie bij de patiëntcontrole tot een minimum te beperken. Er zijn uitgebreide demografische, blootstellings- en klinische gegevens beschikbaar: (1) demografische informatie; (2) details over roken: (3) markers van onderliggende longziekte: (4) bestaande beeldvorming (5) klinische informatie/pathologische bevindingen. Voor deze ICTR-pilot:

1. Doel 1: De hoest wordt opgevangen bij 5 gezonde vrijwilligers en bij 5 huidige rokers voordat ze een bronchoscopie ondergaan. Ook worden onderzoeks-BAL en mondspoelmonsters verzameld. Longspecifieke EV's van deze monsters via deep lung capture (Loudig lab) zullen parallel worden uitgevoerd.

De hoest wordt opgevangen in een aerochamber (gebruikelijke, wegwerpbare in de hand te houden afstandshouder voor dosisinhalatoren/pompen voor astmameters). Het onderzoeksteam heeft ontdekt dat het een adequaat hoestapparaat (geforceerde uitademing) is, in afwachting van verdere optimalisatie. Volgens een geplande wijziging wordt de patiënt geïnstrueerd om elke 30 seconden in de draagbare plastic kamer te hoesten, gedurende een totale periode van 10 minuten. Alle binnenoppervlakken van de gehele kamer worden vervolgens gespoeld met 2-4 ml PBS en het spoelen/wassen wordt snel ingevroren. De spoeling wordt vervolgens verwerkt volgens de te bestuderen analyt. Voor DNA is er een isopropanol/EtOH-precipitatiestap, gevolgd door hersuspensie in een kleiner volume en extractie door Qiagen/Zymo DNA-isolatiekit. Voor eiwit wordt het ruwe extract in PBS direct in de kern verwerkt door precipitatie, drogen, resuspensie in buffer en injectie in het LC-MS-platform voor shotgun-analyses.

De procedure voor het verdelen van EV's wordt gepubliceerd. EV-CATCHER™ kan worden aangepast om zich te richten op unieke oppervlaktemembraaneiwitten die specifiek zijn voor het gewenste celtype en zo de vangst van celspecifieke EV's te sturen. Het Loudig-lab heeft uitgebreide gegevens verzameld die bijvoorbeeld aantonen dat het gebruik van antilichamen gericht op unieke en specifieke eiwitten in diepe longcellen (bijv. Clara Cell Specific Protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) specifiek EV's kan zuiveren van bronchoalveolaire lavages (BAL) en uitgeademde ademcondensaten (EBC) en verkrijg vergelijkbare miRNA-expressieprofielen. Ten slotte kan de intacte afgifte van immunogezuiverde EV's door incubatie met uracilglycosylase (UNG) worden vergemakkelijkt door een enzymatisch afbreekbare, met biotine gelabelde DNA-linker tussen het immobiliserende platform (polystyreen plaat met 96 putjes) en het geactiveerde antilichaam toe te voegen.

Benadering: aliquots van de 10 initiële donoren die hoest-, mondspoel- en BAL-monsters leverden (5 huidige rokers, 5 nooit-rokers) in totaal 30 initiële monsters over alle soorten monsters voor EV-partitionering. Vervolgens worden zowel volledig ongepartitioneerde als EV-gepartitioneerde monsters gegenereerd (in totaal 60 monsters) om te worden getriaged volgens de twee belangrijkste assays, SMM voor somatische mutatie en shotgun proteomics, hieronder, beide voor haalbaarheidsdemonstratie en pilootevaluatie van draagmoederschap van hoest voor de longen.

Doel 2: Hoest zal DNA-mutatieanalyses ondergaan met behulp van SMM. Directe analyse van de integriteit van de genoomsequentie in normale cellen. Een belangrijk probleem bij het bestuderen van de integriteit van de genoomsequentie in normale menselijke weefsels is de willekeurige aard van DNA-mutaties in het genoom. Hoewel sommige mutaties klonaal worden geamplificeerd, is de overgrote meerderheid uniek voor elke cel, en daarom zeldzaam en variant, waardoor amplificatie van het hele genoom van een enkele cel of in vitro klonale amplificatietesten nodig zijn. Beide benaderingen zijn in verband gebracht met artefacten. Onlangs heeft het Maslov/Vijg-lab betrouwbare methoden ontwikkeld om somatische mutaties in afzonderlijke cellen of in klonaal geamplificeerde afzonderlijke cellen kwantitatief te beoordelen. Met behulp van deze methoden werd aangetoond dat basale substitutiemutaties toenemen met roken (en leeftijd) in proximale bronchiale epitheliale basale cellen. Een nieuwere methode voor de kwantitatieve analyse van somatische mutaties, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), is veel kosteneffectiever en kan worden toegepast op kleine hoeveelheden bulk-DNA. Deze nieuwste SMM-seq-methode is belangrijk omdat het onder andere een praktische manier biedt om mutaties in cytologisch normale cellen nauwkeurig te detecteren.

Aanpak: De 20 hoestmonsters (10 ongefractioneerd, 10 gefractioneerd) ondergaan DNA-extractie en bibliotheekvoorbereiding en sequentiëring zoals beschreven in het protocol. Somatische mutaties tussen alle gedetecteerde varianten vinden plaats door aftrekking van kiembaanpolymorfismen die zijn gevonden door analyse van de reguliere sequencing-bibliotheek van DNA van hetzelfde individu. Het aantal somatische varianten is genormaliseerd naar het aantal oproepbare bases, d.w.z. bases met een dekking van meer dan 7x in SMM-seq-bibliotheken en met een dekking van meer dan 20x in reguliere bibliotheken. De somatische mutatiefrequentie zal worden uitgedrukt als een aantal mutaties per genoom. De resterende 40 monsters (20 van mondwater en 20 van BAL) zullen worden verwerkt in het kader van andere lopende financieringsmechanismen, gezien de budgettaire beperkingen.

Doel 3: Hoest, mondwater en BAL ondergaan proteomische analyse met behulp van LC-MS in Einstein's Core-faciliteit. Eerdere proteomics-pogingen bij hoest bestaan ​​niet, voor zover het onderzoeksteam weet, misschien vanwege technische beperkingen van materiaal met een lage abundantie. De proteomics-kern (Sidoli, et al) zal een strategie optimaliseren om de gevoeligheid en snelheid te verbeteren voor het kwantificeren van eiwitten/peptiden met een lage hoeveelheid. Het monstervoorbereidingsprotocol zal worden aangepast om monsterverlies te minimaliseren en nano-vloeistofchromatografie te miniaturiseren in combinatie met state-of-the-art MS om eiwitten/peptiden in BAL-, MW- en EBC-monsters te kwantificeren.

Aanpak: Monstervoorbereiding voor proteomics: het hoestmonster wordt volledig gedroogd en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 5 µl 50 mM ammoniumbicarbonaat (pH = 8) voor canonieke proteomics-monsterbereiding (20 ng trypsine). Het gehele monster wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nano-vloeistofchromatograaf online gekoppeld aan een Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) massaspectrometer. Voor de scheiding zal het lab gebruik maken van een intern verpakte analytische kolom met een minimale interne diameter (50 µm ID, 25 cm lengte) zodat moleculen met een stroomsnelheid van ~100 nL/min kunnen worden gescheiden. De lage stroomsnelheid zorgt voor een verbeterde pre-concentratie van het monster dat uit de kolom elueert, wat leidt tot sub-attomol gevoeligheid.

Data-analyse, inclusief datatransformatie, wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van een pijplijn in het Sidoli-lab. In het kort worden proteomics MS-spectra geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) met drempels die strenger zijn dan momenteel door de gemeenschap wordt aanbevolen voor valse ontdekkingspercentages (<1% FDR voor spectrumovereenkomsten, peptiden en eiwitten). Kwantitatieve waarden worden vervolgens getransformeerd en genormaliseerd zoals beschreven door het Sidoli-lab. Statistische regulatie wordt beoordeeld met behulp van parametrische statistiek (p< 0,05). Chromatogrammen worden handmatig geïnspecteerd, gezien de relatief korte kandidatenlijst.

Alle hoestmonsters (10 niet-gefractioneerde, 10 gefractioneerde x 3 monstertypes = 60 monsters) ondergaan proteomische analyse zoals beschreven.

Vergelijkingen tussen compartimenten: het bepalen van hoestdraagmoederschap voor de long kan op analoge wijze worden uitgevoerd als voor EBC-draagmoederschap voor de long. Binnen een bepaald platform zullen de niveaus (en handtekening) van SMM-mutatie worden vergeleken. In het recente verleden is dit in de uitgeademde microRNA-omgeving (hier niet voorgesteld) uitgevoerd door Spearman-correlaties van microRNA-seq-gegevensclustering in hoofdcomponenten, PCA (niet getoond) en Spearman-correlaties (niet getoond). Voor de proteomics-omgeving kan dit draagmoederschap van hoest voor long op dezelfde manier worden aangetoond voor hoest door heatmaps, PCA en methoden zoals Spearman-correlatie te clusteren.

Resultaat: Deze eerste proeftest van hoest als een nieuw biospecimenplatform is pragmatisch vertaalwerk met een hoog risico en een hoge beloning. Als uit dit proefproject blijkt dat hoest een geldig surrogaat is voor de longen, op de twee onderzochte platforms, dan zal dat sterk voorlopig bewijs opleveren voor het ondersteunen van verdere federale financiering. Dit potentieel voor een op de luchtwegen gebaseerd portaal naar de long kan worden overwogen voor een breed scala aan acute en chronische klinische en volksgezondheidsdoeleinden.