Köhögésrögzítés portálként a tüdőbe (CC1)

Hipotézis: A köhögés érvényes non-invazív helyettesítője lehet a tüdőnek olyan nagy molekulák számára, mint a DNS és a fehérjék, potenciálisan különféle klinikai és közegészségügyi célokra.

Javaslat röviden: Egy epidemiológiai és klinikailag alkalmazható platform kifejlesztése érdekében egyedülállóan a mély tüdőből befogott nagy molekulák számára a kutatócsoport új megközelítést alkalmaz, amely magában foglalja a köhögés összegyűjtését, valamint a köhögésminta mélytüdőben történő szétválasztásának hatékonyságát és praktikusságát. specifikus extracelluláris vezikulák (EV-k). Ezt a köhögésről származó mintát összehasonlítjuk az invazív módon gyűjtött mélytüdőminták BAL/hörgő fogmosásából származó mintájával, valamint a potenciálisan szennyező szájöblítővel, amelyek mindegyike ugyanazon személyektől származik. A kutatócsoport kezdetben azt javasolja, hogy vizsgálják meg ezeket a nyers köhögésmintákat, majd az EV-vel felosztott légúti mintákat a szomatikus mutációk szomatikus mutációk SMM tömeges szekvenálásával, a Vijg/Maslov laborokban kifejlesztett legkorszerűbb technikákkal, valamint az ismerten specifikus fehérjékkel. a tüdő számára, szemben a szájüreggel/nyállal, a Sidoli/proteomics magban.

Konkrét célok:

1. A köhögést aerokamrával vagy azzal egyenértékű/optimalizált eszközzel rögzítik 5 egészséges önkéntesnél és 5 jelenleg dohányzónál, párhuzamosan szájöblítéssel és BAL-lel. Ugyanezen mintákból származó tüdő-specifikus EV-k mélytüdőfelvétellel (Loudig labor) párhuzamosan kerülnek végrehajtásra.
2. A köhögés során DNS-mutációs analízist végeznek egymolekula mutációs szekvenálás (SMM-seq) segítségével.
3. A köhögést, a szájvizet és a BAL-t LC-MS segítségével proteomikai elemzésnek vetjük alá Core létesítményünkben.

Megközelítés:

A Human Lung Studies protokoll gyakorlatai általában: A folyamatban lévő alanyok felvétele egy régóta IRB által jóváhagyott Einstein-Montefiore klinikai eset-ellenőrzési protokoll része (2007-407). A tüdőgyógyászati ​​szakrendelésen részt vevő személyek jelentkezhetnek: 21 év feletti életkor, bármilyen dohányzási státusz, számtalan komorbid állapot, kivéve a BAL ellenjavallatát, a klinikailag indikált tüdőgyűjtési eljárás (bronchoszkópia) a rutin ellátás részeként tervezett. Ez évente több mint 100-150 hörgőtükrözést és a kapcsolódó korábbi dohányos donort jelent. Több mint 150-200 ilyen, már létező bronchoszkópos mintakészlet és a hozzátartozó nem invazív EBC, valamint MW, bukkális ecset és egyebek állnak rendelkezésre, és potenciálisan elérhetőek a jelenlegi vizsgálathoz. Minden adatot/mintát a diagnózis és az eljárás előtt gyűjtenek; minden alany EBC (és egyéb nem invazív, például köhögés) mintákat ad a bronchoszkópia előtt. Mint ilyen, ez az aktív protokoll minimalizálja (i) visszahívási torzítást; és ii. a nem invazív minták szennyeződése a tüdőszövet e tüdőműveletekkel járó megsértése és kiömlése következtében. Minden alanyt 3 hónapig követnek az orvosi nyilvántartásban, hogy összegyűjtsék a frissített diagnosztikát/teszteket, és minimalizálják az eset-ellenőrzés téves besorolását. Széleskörű demográfiai, expozíciós és klinikai adatok állnak rendelkezésre: (1) demográfiai információk; (2) a dohányzás részletei: (3) a mögöttes tüdőbetegség markerei: (4) meglévő képalkotás (5) klinikai információk/patológiai leletek. Ehhez az ICTR pilothoz:

1. 1. cél: A köhögést 5 egészséges önkéntesnél és 5 jelenleg dohányzónál rögzítik a bronchoszkópia előtt. Kutatási BAL és szájöblítő mintákat is gyűjtenek. Ezekből a mintákból a mélytüdőbefogással (Loudig labor) párhuzamosan végzik a tüdőspecifikus elektromobilitást.

A köhögést légkamrában rögzítik (közös, eldobható kézi távtartó eszköz asztmamérő adagoló inhalátorokhoz/pumpákhoz). A kutatócsoport úgy találta, hogy ez egy megfelelő köhögés (kényszerített kilégzés) rögzítő eszköz, a további optimalizálásig. A tervezett módosítás értelmében a pácienst arra utasítják, hogy 30 másodpercenként köhögjön be a kézi műanyag kamrába, összesen 10 percig. Ezután a teljes kamra minden belső felületét leöblítjük 2-4 ml PBS-sel, és az öblítőt/mosást pillanatok alatt lefagyasztjuk. Az öblítést ezt követően a vizsgálandó analitnak megfelelően dolgozzák fel. A DNS esetében van egy izopropanol/etOH kicsapási lépés, amelyet kisebb térfogatú újraszuszpendálás követ, majd a Qiagen/Zymo DNS izolációs kittel történő extrakció. A fehérje esetében a PBS-ben lévő nyers kivonatot közvetlenül a magban kezelik kicsapással, szárítással, pufferben való újraszuszpendálással és az LC-MS platformba történő befecskendezéssel a shotgun elemzésekhez.

Megjelent az EV particionálási eljárás. Az EV-CATCHER™ testreszabható a kívánt sejttípusra jellemző egyedi felszíni membránfehérjék megcélzására, és ezáltal a sejtspecifikus EV-k közvetlen befogására. A Loudig laboratórium kiterjedt adatokat gyűjtött össze, amelyek igazolják például, hogy a mélytüdősejtek egyedi és specifikus fehérjéit célzó antitestek (pl. Clara Cell Specific protein (CCSP), alveoláris típusú 2-es típusú sejt felületaktív fehérje-C (SFTPC)) segítségével specifikusan meg lehet tisztítani az elektromos járműveket. Bronchoalveolaris lavages (BAL) és kilégzési kondenzátumból (EBC) és hasonló miRNS expressziós profilokat kapunk. Végül egy enzimatikusan lebontható uracilezett, kettős szálú biotinnal jelölt DNS-linker hozzáadásával az immobilizáló platform (96-lyukú polisztirol lemez) és az aktivált antitest közé az immuntisztított EV-k ép felszabadulása uracil-glikozilázzal (UNG) történő inkubálással elősegíthető.

Megközelítés: A 10 kezdeti donor alikvotjai, akik köhögés-, szájöblítő- és BAL-mintákat adtak (5 jelenleg dohányzó, 5 soha nem dohányzó), összesen 30 kezdeti minta az összes mintatípusból az EV-megosztáshoz. Ezután mind a teljes felosztás nélküli, mind az EV-particionált mintákat generálják (összesen 60 mintát), amelyeket a két fő vizsgálati módszerrel, az alábbi SMM-sel a szomatikus mutációval és a shotgun proteomikával tesztelnek, mind a megvalósíthatósági demonstráció, mind a béranyaság kísérleti értékelése céljából. köhögés a tüdő számára.

2. cél: A köhögést DNS-mutációs elemzésnek vetik alá SMM segítségével. A genom szekvencia integritásának közvetlen elemzése normál sejtekben. A normál emberi szövetekben a genomszekvencia integritásának tanulmányozásában kulcsprobléma a DNS-mutációk véletlenszerű természete a genomban. Míg egyes mutációk klonálisan amplifikálódnak, túlnyomó többségük egyedi az egyes sejtekben, ezért ritkák és változatosak, ami egysejtű teljes genom amplifikációt vagy in vitro klonális amplifikációs vizsgálatokat tesz szükségessé. Mindkét megközelítést műtermékekkel társították. A Maslov/Vijg laboratórium a közelmúltban megbízható módszereket fejlesztett ki a szomatikus mutációk kvantitatív értékelésére egyedi sejtekben vagy klonálisan amplifikált egyedi sejtekben. Ezekkel a módszerekkel kimutattuk, hogy a proximális bronchiális epiteliális bazális sejtekben a bázisszubsztitúciós mutációk a dohányzás (és az életkor) növekedésével növekednek. A szomatikus mutációk kvantitatív elemzésének újabb módszere, az SMM-seq (Single Molecule Mutation-seq) sokkal költséghatékonyabb, és kis mennyiségű ömlesztett DNS-re is alkalmazható. Ez a legújabb SMM-seq módszer azért jelentős, mert lehetővé teszi, többek között, egy gyakorlati eszközt a mutációk pontos kimutatására citológiailag normális sejtekben.

Megközelítés: A 20 köhögésminta (10 frakcionálatlan, 10 frakcionált) DNS-kivonáson, könyvtár-előkészítésen és szekvenáláson megy keresztül a protokollban leírtak szerint. Az összes kimutatott variáns szomatikus mutációi úgy jönnek létre, hogy kivonják a csíravonal polimorfizmusait, amelyeket ugyanazon egyed DNS-éből származó szabályos szekvenálási könyvtár elemzésével találtak. A szomatikus változatok számát a hívható bázisok számára normalizálják, azaz az SMM-seq könyvtárakban több mint 7-szeres lefedettségű bázisok, a normál könyvtárakban pedig több mint 20-szoros lefedettségű bázisok. A szomatikus mutációk gyakoriságát genomonkénti mutációk számában fejezzük ki. A fennmaradó 40 mintát (20 szájvízből és 20 BAL-ból) más folyamatban lévő finanszírozási mechanizmusok keretében dolgozzák fel, tekintettel a költségvetési korlátokra.

3. cél: A köhögés, a szájvíz és a BAL proteomikai analízisen mennek keresztül LC-MS segítségével Einstein Core létesítményében. A köhögéssel kapcsolatos korábbi proteomikai kísérletek a kutatócsoport tudomása szerint nem léteznek, talán az alacsony mennyiségû anyag technikai korlátai miatt. A proteomikai mag (Sidoli és munkatársai) optimalizálni fogja az érzékenységet és a sebességet az alacsony mennyiségben előforduló fehérjék/peptidek mennyiségi meghatározásához. A minta-előkészítési protokollt módosítják, hogy minimalizálják a mintaveszteséget, és miniatürizálják a nano-folyadék kromatográfiát a legmodernebb MS-sel párosítva a fehérjék/peptidek mennyiségi meghatározásához a BAL, MW és EBC mintákban.

Megközelítés: Minta-előkészítés proteomikai célokra: A köhögésből származó mintát teljesen megszárítjuk, majd 5 µl 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátban (pH = 8) újraszuszpendáljuk a kanonikus proteomikai minta-előkészítéshez (20 ng tripszin). A teljes mintát ezután Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nano-folyadék kromatográfussal elemezzük, összekapcsolva egy Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) tömegspektrométerrel. Az elválasztáshoz a laboratórium egy házon belüli, minimális belső átmérőjű (50 µm belső átmérőjű, 25 cm hosszúságú) analitikai oszlopot használ, így ~100 nl/perc áramlási sebességű molekulák választhatók szét. Az alacsony áramlási sebesség fokozza az oszlopról eluálódó minta előkoncentrációját, ami szubatomol érzékenységhez vezet.

Az adatelemzést, beleértve az adatátalakítást is, ezután a Sidoli laborban egy folyamat segítségével végzik el. Röviden, a proteomikai MS-spektrumokat a Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) segítségével azonosítják és számszerűsítik, szigorúbb küszöbértékekkel, mint a közösség által jelenleg javasolt téves felfedezési arány (<1% FDR spektrumegyezések, peptidek és fehérjék esetében). A mennyiségi értékeket ezután a Sidoli labor leírása szerint átalakítjuk és normalizáljuk. A statisztikai szabályozást parametrikus statisztika segítségével értékeljük (p<0,05). A kromatogramokat manuálisan ellenőrzik, tekintettel a jelöltek viszonylag rövid listájára.

Minden köhögési mintán (10 frakcionálatlan, 10 frakcionált x 3 mintatípus = 60 minta) proteomikai elemzésnek kell alávetni a leírtak szerint.

Keresztrekesz-összehasonlítások: A tüdő köhögés-helyettesítésének meghatározása a tüdő EBC-helyettesítéseihez hasonló módon történhet. Egy adott platformon belül az SMM mutáció szintjeit (és aláírását) összehasonlítják. A közelmúltban a kilélegzett mikroRNS-környezetben (itt nem javasolt) ezt Spearman-korrelációkkal végezték a mikroRNS-seq adatok klasztereződésében a fő komponensekben, a PCA (nincs ábrázolva) és a Spearman-korrelációk (nem látható). A proteomikai környezetben a tüdő köhögésének ez a helyettesítője hasonlóképpen kimutatható a köhögésre hőtérképek, PCA csoportosításával és olyan módszerekkel, mint a Spearman-korreláció.

Eredmény: A köhögés kezdeti kísérleti tesztelése, mint egy új platform biominta, nagy kockázatot és nagy hasznot hozó pragmatikus transzlációs munka. Ha ez a kísérleti projekt azt mutatja, hogy a köhögés a tüdő megfelelő helyettesítője a két vizsgált platformon, akkor ez erős előzetes bizonyítékot jelent a további szövetségi finanszírozás támogatására. A tüdő légúti alapú portáljának ez a lehetősége a sokféle akut és krónikus klinikai és közegészségügyi célra elképzelhető.