Zachycení kašle jako portál do plic (CC1)

Hypotéza: Kašel může sloužit jako platná neinvazivní náhrada plic pro velké molekuly, jako je DNA a proteiny, potenciálně pro různé klinické účely a účely veřejného zdraví.

Stručný návrh: Pro vývoj epidemiologické a klinicky použitelné platformy pro velké molekuly zachycené jedinečně z hlubokých plic bude výzkumný tým usilovat o nový přístup, který zahrnuje sběr kašle a testování účinnosti a praktičnosti rozdělování vzorku kašle pro hluboké plíce. specifické extracelulární vezikuly (EV). Tento vzorek proti kašli bude porovnán se vzorkem z invazivně odebraných hlubokých plicních vzorků BAL/bronchiálních kartáčků a s potenciálně kontaminující ústní vodou, to vše od stejných jedinců. Studijní tým zpočátku navrhuje prozkoumat tyto vzorky surového kašle a poté vzorky z dýchacích cest rozdělené EV na somatické mutace pomocí hromadného sekvenování somatických mutací SMM, nejmodernějších technik vyvinutých v laboratořích Vijg/Maslov a na proteiny, o kterých je známo, že jsou specifické. pro plíce, na rozdíl od ústní dutiny/slin, v jádru Sidoli/proteomika.

Konkrétní cíle:

1. Kašel bude zachycen aerokomorou nebo ekvivalentním/optimalizovaným zařízením u 5 zdravých dobrovolníků a u 5 současných kuřáků, souběžně s ústní vodou a BAL. Paralelně budou prováděny plicně specifické EV z těchto stejných vzorků prostřednictvím hlubokého zachycení plic (Loudigova laboratoř).
2. Kašel bude podroben analýze mutací DNA pomocí sekvenování mutace jedné molekuly (SMM-seq).
3. Kašel, ústní voda a BAL podstoupí proteomickou analýzu pomocí LC-MS v našem základním zařízení.

Přístup:

Postupy protokolů studií lidských plic obecně: Průběžné zařazování subjektů je součástí dlouhodobého protokolu Einstein-Montefiore klinického případu a kontroly schváleného IRB (2007-407). Jedinci z plicních ordinací způsobilí k zápisu jsou: Věk > 21 let, jakýkoli kuřácký stav, nesčetné komorbidní stavy kromě kontraindikací k BAL, plánované pro klinicky indikovaný postup odběru plic (bronchoskopie) jako součást rutinní péče. To představuje více než 100-150 bronchoskopií a souvisejících bývalých dárců kuřáků ročně. Více než 150–200 takových již existujících bronchoskopických sad vzorků a doprovodné neinvazivní EBC, spolu s MW, bukálním kartáčkem a dalšími] je uloženo a potenciálně dostupné pro současnou studii. Všechna data/vzorky se shromažďují před diagnózou a před procedurou; každý subjekt poskytuje vzorky EBC (a další neinvazivní, jako je kašel) prebronchoskopii. Jako takový tento aktivní protokol minimalizuje (i) zkreslení vyvolání; a (ii) kontaminaci neinvazivních vzorků z narušení a rozlití plicní tkáně, která je vlastní těmto plicním procedurám. Každý subjekt bude sledován po dobu 3 měsíců v lékařském záznamu, aby se shromáždila aktualizovaná diagnostika/testování a minimalizovala se nesprávná klasifikace případu a kontroly. K dispozici jsou rozsáhlé demografické údaje, údaje o expozici a klinické údaje: (1) demografické informace; (2) podrobnosti o kouření: (3) markery základního plicního onemocnění: (4) existující zobrazovací metody (5) klinické informace/patologické nálezy. Pro tohoto pilota ICTR:

1. Cíl 1: Kašel bude zachycen u 5 zdravých dobrovolníků au 5 současných kuřáků před bronchoskopií. Budou také odebrány vzorky BAL a ústní vody. Paralelně budou prováděny plicně specifické EV z těchto vzorků prostřednictvím hlubokého zachycení plic (Loudigova laboratoř).

Kašel bude zachycován v aerokomoře (běžné, jednorázové ruční distanční zařízení pro dávkovací inhalátory/pumpy astmatu). Tým vyšetřovatelů zjistil, že je to adekvátní zařízení pro zachycení kašle (nuceného výdechu), čeká se na další optimalizaci. Podle plánovaného dodatku je pacient instruován, aby kašlal každých 30 sekund do ruční plastové komory po dobu 10 minut. Všechny vnitřní povrchy celé komory se poté opláchnou 2-4 ml PBS a výplach/promytí se rychle zmrazí. Oplach je následně zpracován podle analytu, který má být studován. V případě DNA existuje krok srážení isopropanolem/EtOH, po kterém následuje resuspendování v menším objemu a extrakce pomocí Qiagen/Zymo DNA izolační sady. V případě proteinu se surový extrakt v PBS zpracovává přímo v jádře precipitací, sušením, resuspenzí v pufru a injekcí do platformy LC-MS pro analýzy brokovnicí.

Postup rozdělení EV je zveřejněn. EV-CATCHER™ lze upravit tak, aby cílil na jedinečné povrchové membránové proteiny specifické pro požadovaný typ buňky, a tak přímo zachytil EV specifické pro buňky. Laboratoř Loudig shromáždila rozsáhlá data prokazující například, že použití protilátek cílených na jedinečné a specifické proteiny hlubokých plicních buněk (např. Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) může specificky purifikovat EV z bronchoalveolárních výplachů (BAL) a kondenzátů vydechovaného dechu (EBC) a získat podobné profily exprese miRNA. Konečně přidáním enzymaticky degradovatelného uracylovaného dvouvláknového biotinem značeného DNA linkeru mezi imobilizační platformu (polystyrenová 96jamková destička) a aktivovanou protilátku lze usnadnit intaktní uvolňování imunopurifikovaných EV inkubací s uracil glykosylázou (UNG).

Přístup: Alikvoty od 10 počátečních dárců poskytujících vzorky pro kašel, ústní vodu a BAL (5 současných kuřáků, 5 nikdy nekuřáků), celkem 30 počátečních vzorků ze všech typů vzorků pro rozdělení EV. Poté budou generovány jak celé nerozdělené, tak EV rozdělené vzorky (celkem 60 vzorků), které budou tříděny do dvou hlavních testů, SMM pro somatickou mutaci a brokovnicové proteomiky, oba pro demonstraci proveditelnosti a pilotní hodnocení náhradního mateřství. kašel na plíce.

Cíl 2: Kašel bude podroben analýze mutace DNA pomocí SMM. Přímá analýza integrity genomové sekvence v normálních buňkách. Klíčovým problémem při studiu integrity genomové sekvence v normálních lidských tkáních je náhodná povaha mutací DNA v genomu. Zatímco některé mutace jsou klonově amplifikovány, velká většina je jedinečná pro každou buňku, a proto vzácná a variantní, což vyžaduje buď jednobuněčnou celogenomovou amplifikaci nebo in vitro klonální amplifikační testy. Oba přístupy byly spojeny s artefakty. Nedávno laboratoř Maslov/Vijg vyvinula spolehlivé metody pro kvantitativní hodnocení somatických mutací v jednotlivých buňkách nebo v klonálně amplifikovaných jednotlivých buňkách. Pomocí těchto metod bylo prokázáno, že substituční mutace báze se zvyšují s kouřením (a věkem) v bazálních buňkách proximálního bronchiálního epitelu. Novější metoda pro kvantitativní analýzu somatických mutací, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), je mnohem efektivnější z hlediska nákladů a lze ji aplikovat na malá množství objemové DNA. Tato nejnovější metoda SMM-seq je významná, protože umožňuje, kromě jiných úvah, praktický prostředek k přesné detekci mutací v cytologicky normálních buňkách.

Přístup: 20 vzorků od kašle (10 nefrakcionovaných, 10 frakcionovaných) bude podrobeno extrakci DNA a přípravě knihovny a sekvenování, jak je popsáno v protokolu. Somatické mutace mezi všemi detekovanými variantami nastávají odečtením zárodečných polymorfismů zjištěných analýzou pravidelné sekvenační knihovny od DNA téhož jedince. Počet somatických variant je normalizován na počet volatelných bází, tj. bází s pokrytím více než 7X v knihovnách SMM-seq a s pokrytím více než 20X v běžných knihovnách. Frekvence somatických mutací bude vyjádřena jako počet mutací na genom. Zbývajících 40 vzorků (20 z ústní vody a 20 z BAL) bude s ohledem na rozpočtová omezení zpracováno v rámci jiných průběžných mechanismů financování.

Cíl 3: Kašel, ústní voda a BAL podstoupí proteomickou analýzu pomocí LC-MS v zařízení Einstein's Core. Dřívější pokusy o proteomiku u kašle neexistují, pokud výzkumný tým věděl, možná kvůli technickým omezením materiálu s nízkou četností. Proteomické jádro (Sidoli a kol.) bude optimalizovat strategii pro zvýšení citlivosti a rychlosti pro kvantifikaci proteinů/peptidů s nízkým výskytem. Protokol přípravy vzorku bude upraven tak, aby se minimalizovaly ztráty vzorku a miniaturizovala se nano-kapalinová chromatografie spojená s nejmodernější MS pro kvantifikaci proteinů/peptidů ve vzorcích BAL, MW a EBC.

Přístup: Příprava vzorku pro proteomiku: Vzorek proti kašli se úplně vysuší a poté se resuspenduje v 5 ul 50 mM hydrogenuhličitanu amonného (pH = 8) pro přípravu kanonických vzorků proteomiky (20 ng trypsinu). Celý vzorek je poté analyzován pomocí nanokapalinového chromatografu Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) spojeného online s hmotnostním spektrometrem Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Pro separaci bude laboratoř využívat vlastní plněnou analytickou kolonu s minimálním vnitřním průměrem (50 µm ID, 25 cm délka), aby bylo možné separovat molekuly s průtokem ~100 nL/min. Nízký průtok poskytuje zvýšenou předkoncentraci vzorku eluovaného z kolony, což vede k subatomolové citlivosti.

Analýza dat včetně transformace dat je pak provedena pomocí potrubí v laboratoři Sidoli. Stručně řečeno, proteomická MS spektra jsou identifikována a kvantifikována pomocí Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) s přísnějšími prahovými hodnotami, než je v současnosti doporučeno komunitou pro míru falešných objevů (<1 % FDR pro shody spektra, peptidy a proteiny). Kvantitativní hodnoty jsou pak transformovány a normalizovány, jak je popsáno v laboratoři Sidoli. Statistická regulace je hodnocena pomocí parametrické statistiky (p< 0,05). Chromatogramy se kontrolují ručně, vzhledem k relativně krátkému seznamu kandidátů.

Všechny vzorky kašle (10 nefrakcionovaných, 10 frakcionovaných x 3 typy vzorků = 60 vzorků) budou podrobeny proteomické analýze, jak je popsáno.

Srovnání napříč odděleními: Stanovení náhradního mateřství za kašel u plic lze provést analogickým způsobem jako u náhradního mateřství plic EBC. V rámci dané platformy budou porovnány úrovně (a signatura) mutace SMM. V nedávné minulosti v prostředí vydechované mikroRNA (zde není navrženo) to bylo provedeno Spearmanovými korelacemi shlukování dat microRNA-seq v hlavních složkách, PCA (nezobrazeno) a Spearmanovými korelacemi (nezobrazeno). Pro proteomické prostředí může být tato náhrada kašle za plíce prokázána pro kašel podobně pomocí shlukování teplotních map, PCA a metod, jako je Spearmanova korelace.

Výsledek: Toto počáteční pilotní testování kašle jako nového biovzorku platformy je vysoce riziková pragmatická translační práce s vysokou odměnou. Pokud tento pilotní projekt ukáže, že kašel je platnou náhradou za plíce, na dvou zkoumaných platformách, pak to poskytne silný předběžný důkaz pro podporu dalšího federálního financování. Tento potenciál pro portál do plic založený na dýchacích cestách lze předpokládat pro širokou škálu akutních a chronických klinických a veřejných zdravotních účelů.