Husteneinfang als Portal in die Lunge (CC1)

Hypothese: Husten kann als gültiger nicht-invasiver Ersatz für die Lunge für große Moleküle wie DNA und Proteine ​​dienen, möglicherweise für eine Vielzahl klinischer und öffentlicher Gesundheitszwecke.

Vorschlag in Kürze: Für die Entwicklung einer epidemiologischen und klinisch anwendbaren Plattform für große Moleküle, die ausschließlich aus der tiefen Lunge erfasst werden, wird das Forscherteam einen neuen Ansatz verfolgen, der die Sammlung von Husten umfasst und die Wirksamkeit und Praktikabilität der Aufteilung von Hustenproben für die tiefe Lunge testet spezifische extrazelluläre Vesikel (EVs). Diese Hustenprobe wird mit der aus invasiv entnommenen tiefen Lungenproben, BAL/Bronchialbürsten und mit der potenziell kontaminierenden Mundspülung, alle von denselben Personen, verglichen. Das Studienteam schlägt zunächst vor, diese rohen Hustenproben und dann EV-partitionierte Atemwegsproben auf somatische Mutationen durch SMM-Massensequenzierung auf somatische Mutationen, modernste Techniken, die in den Vijg/Maslov-Laboren entwickelt wurden, und auf Proteine ​​zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie spezifisch sind für die Lunge, im Gegensatz zu Mundhöhle/Speichel, im Sidoli/Proteomics-Kern.

Spezifische Ziele:

1. Der Husten wird bei 5 gesunden Freiwilligen und bei 5 aktuellen Rauchern durch eine Luftkammer oder ein gleichwertiges/optimiertes Gerät erfasst, parallel zu Mundspülung und BAL. Parallel werden lungenspezifische EVs aus denselben Proben mittels Deep Lung Capture (Loudig-Labor) durchgeführt.
2. Husten wird einer DNA-Mutationsanalyse mittels Einzelmolekül-Mutationssequenzierung (SMM-seq) unterzogen.
3. Husten, Mundwasser und BAL werden in unserer Kerneinrichtung einer Proteomanalyse mittels LC-MS unterzogen.

Ansatz:

Protokollpraktiken für Studien zur menschlichen Lunge im Allgemeinen: Die fortlaufende Rekrutierung von Probanden ist Teil eines langjährigen, vom IRB genehmigten klinischen Fallkontrollprotokolls nach Einstein-Montefiore (2007-407). Personen aus Lungenarztpraxen, die zur Einschreibung berechtigt sind, sind: Alter > 21 Jahre, jeglicher Raucherstatus, unzählige Komorbiditätsstatus mit Ausnahme von Kontraindikationen für BAL, geplante klinisch indizierte Lungenentnahme (Bronchoskopie) als Teil der Routineversorgung. Dies entspricht mehr als 100–150 Bronchoskopie- und damit verbundenen ehemaligen Raucherspendern pro Jahr. Über 150–200 solcher bereits vorhandenen bronchoskopischen Probensätze und begleitender nicht-invasiver EBC, zusammen mit MW, bukkaler Bürste und anderen] sind gespeichert und möglicherweise für die aktuelle Studie verfügbar. Alle Daten/Proben werden vor der Diagnose und vor dem Eingriff gesammelt; Jeder Proband stellt vor der Bronchoskopie EBC-Proben (und andere nicht-invasive Proben wie Husten) zur Verfügung. Daher minimiert dieses aktive Protokoll (i) die Rückrufverzerrung; und (ii) Kontamination nicht-invasiver Proben durch die mit diesen Lungeneingriffen verbundenen Störungen und Verschüttungen des Lungengewebes. Jeder Proband wird drei Monate lang in der Krankenakte verfolgt, um aktualisierte Diagnosen/Tests zu sammeln und Fehlklassifizierungen bei der Fallkontrolle zu minimieren. Es stehen umfangreiche demografische, Expositions- und klinische Daten zur Verfügung: (1) demografische Informationen; (2) Angaben zum Rauchen: (3) Marker einer zugrunde liegenden Lungenerkrankung: (4) vorhandene Bildgebung, (5) klinische Informationen/pathologische Befunde. Für dieses ICTR-Pilotprojekt:

1. Ziel 1: Husten wird bei 5 gesunden Freiwilligen und bei 5 aktuellen Rauchern vor einer Bronchoskopie erfasst. Es werden auch BAL- und Mundspülproben für Forschungszwecke gesammelt. Parallel werden lungenspezifische EVs aus diesen Proben mittels Deep Lung Capture (Loudig-Labor) durchgeführt.

Husten wird in der Luftkammer erfasst (übliches, tragbares Einweg-Abstandsgerät für Asthma-Messgerät-Dosis-Inhalatoren/-Pumpen). Das Forscherteam hat festgestellt, dass es sich um ein geeignetes Gerät zur Erfassung von Husten (erzwungenes Ausatmen) handelt, bis zur weiteren Optimierung. Im Rahmen einer geplanten Änderung wird der Patient angewiesen, über einen Zeitraum von insgesamt 10 Minuten alle 30 Sekunden in die tragbare Kunststoffkammer zu husten. Alle Innenflächen der gesamten Kammer werden dann mit 2–4 ml PBS gespült und die Spülung/Waschlösung wird schockgefroren. Anschließend wird die Spülung entsprechend dem zu untersuchenden Analyten aufbereitet. Für DNA gibt es einen Isopropanol/EtOH-Fällungsschritt, gefolgt von einer Resuspension in einem kleineren Volumen und einer Extraktion mit dem Qiagen/Zymo DNA-Isolierungskit. Bei Proteinen wird der Rohextrakt in PBS direkt im Kern durch Fällung, Trocknung, Resuspension in Puffer und Injektion in die LC-MS-Plattform für Shotgun-Analysen verarbeitet.

Das EV-Partitionierungsverfahren wird veröffentlicht. EV-CATCHER™ kann so angepasst werden, dass es auf einzigartige Oberflächenmembranproteine ​​abzielt, die für den gewünschten Zelltyp spezifisch sind, und so zellspezifische EVs direkt einfangen kann. Das Loudig-Labor hat umfangreiche Daten zusammengestellt, die beispielsweise zeigen, dass die Verwendung von Antikörpern, die auf einzigartige und spezifische Proteine ​​tiefer Lungenzellen abzielen (z. B. Clara Cell Specific Protein (CCSP), Alveolar Typ 2 Cell Surfactant Protein-C (SFTPC)), Elektrofahrzeuge gezielt reinigen kann aus bronchoalveolären Lavagen (BAL) und ausgeatmeten Atemkondensaten (EBC) und erhalten ähnliche miRNA-Expressionsprofile. Schließlich kann durch Hinzufügen eines enzymatisch abbaubaren uracylierten doppelsträngigen Biotin-markierten DNA-Linkers zwischen der Immobilisierungsplattform (Polystyrol-96-Well-Platte) und dem aktivierten Antikörper die intakte Freisetzung immungereinigter EVs durch Inkubation mit Uracilglycosylase (UNG) erleichtert werden.

Ansatz: Aliquote der 10 Erstspender, die Husten-, Mundspül- und BAL-Proben bereitstellen (5 aktuelle Raucher, 5 Niemalsraucher), insgesamt 30 Erstproben aller Probentypen für die EV-Aufteilung. Anschließend werden sowohl vollständig unpartitionierte als auch EV-partitionierte Proben generiert (insgesamt 60 Proben), die für die beiden folgenden Haupttests, SMM für somatische Mutation und Shotgun-Proteomik, triagiert werden, sowohl zur Machbarkeitsdemonstration als auch zur Pilotbewertung der Leihmutterschaft Husten für die Lunge.

Ziel 2: Husten wird mittels SMM einer DNA-Mutationsanalyse unterzogen. Direkte Analyse der Integrität der Genomsequenz in normalen Zellen. Ein zentrales Problem bei der Untersuchung der Integrität der Genomsequenz in normalen menschlichen Geweben ist die zufällige Natur von DNA-Mutationen im Genom. Während einige Mutationen klonal amplifiziert werden, ist die überwiegende Mehrheit für jede Zelle einzigartig und daher selten und vielfältig, was entweder die Amplifikation des gesamten Genoms einer einzelnen Zelle oder klonale Amplifikationstests in vitro erfordert. Beide Ansätze wurden mit Artefakten in Verbindung gebracht. Kürzlich hat das Maslov/Vijg-Labor zuverlässige Methoden zur quantitativen Bewertung somatischer Mutationen in einzelnen Zellen oder in klonal amplifizierten Einzelzellen entwickelt. Mit diesen Methoden konnte gezeigt werden, dass Basalsubstitutionsmutationen mit dem Rauchen (und dem Alter) in den Basalzellen des proximalen Bronchialepithels zunehmen. Eine neuere Methode zur quantitativen Analyse somatischer Mutationen, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), ist viel kostengünstiger und kann auf kleine Mengen großer DNA angewendet werden. Diese neueste SMM-seq-Methode ist von Bedeutung, weil sie unter anderem ein praktisches Mittel zum genauen Nachweis von Mutationen in zytologisch normalen Zellen bietet.

Vorgehensweise: Die 20 Hustenproben (10 unfraktionierte, 10 fraktionierte) werden einer DNA-Extraktion sowie einer Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung unterzogen, wie im Protokoll beschrieben. Somatische Mutationen unter allen erkannten Varianten erfolgen durch Subtraktion von Keimbahnpolymorphismen, die durch Analyse der regulären Sequenzierungsbibliothek aus der DNA desselben Individuums gefunden wurden. Die Anzahl der somatischen Varianten wird auf die Anzahl der aufrufbaren Basen normalisiert, d. h. Basen mit einer Abdeckung von mehr als dem 7-fachen in SMM-seq-Bibliotheken und mit einer Abdeckung von mehr als dem 20-fachen in regulären Bibliotheken. Die Häufigkeit somatischer Mutationen wird als Anzahl der Mutationen pro Genom ausgedrückt. Die verbleibenden 40 Proben (20 von Mundwasser und 20 von BAL) werden aufgrund der Budgetbeschränkungen im Rahmen anderer laufender Finanzierungsmechanismen verarbeitet.

Ziel 3: Husten, Mundwasser und BAL werden einer Proteomanalyse mittels LC-MS in Einsteins Core-Einrichtung unterzogen. Frühere Versuche zur Proteomik bei Husten liegen nach Kenntnis des Forscherteams nicht vor, möglicherweise aufgrund technischer Einschränkungen von Material mit geringer Häufigkeit. Der Proteomics-Kern (Sidoli et al.) wird eine Strategie optimieren, um die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit bei der Quantifizierung von Proteinen/Peptiden mit geringer Häufigkeit zu erhöhen. Das Probenvorbereitungsprotokoll wird geändert, um Probenverluste zu minimieren und die Nanoflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit modernster MS zu miniaturisieren, um Proteine/Peptide in BAL-, MW- und EBC-Proben zu quantifizieren.

Ansatz: Probenvorbereitung für die Proteomik: Die Hustenprobe wird vollständig getrocknet und dann in 5 µL 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH = 8) für die kanonische Proteomik-Probenvorbereitung (20 ng Trypsin) resuspendiert. Die gesamte Probe wird dann mit einem Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) Nano-Flüssigkeitschromatographen analysiert, der online mit einem Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) Massenspektrometer gekoppelt ist. Zur Trennung wird das Labor eine hauseigene gepackte Analysesäule mit minimalem Innendurchmesser (50 µm Innendurchmesser, 25 cm Länge) verwenden, sodass Moleküle mit einer Flussrate von ~100 nL/min getrennt werden können. Die niedrige Flussrate sorgt für eine verbesserte Vorkonzentration der aus der Säule eluierenden Probe, was zu einer Empfindlichkeit im Sub-Attomol-Bereich führt.

Die Datenanalyse, einschließlich der Datentransformation, wird dann mithilfe einer Pipeline im Sidoli-Labor durchgeführt. Kurz gesagt, Proteomics-MS-Spektren werden mit Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) identifiziert und quantifiziert, wobei die Schwellenwerte strenger sind als derzeit von der Community für die Falscherkennungsrate empfohlen (<1 % FDR für Spektrumübereinstimmungen, Peptide und Proteine). Quantitative Werte werden dann wie vom Sidoli-Labor beschrieben transformiert und normalisiert. Die statistische Regulierung wird mithilfe parametrischer Statistiken bewertet (p < 0,05). Aufgrund der relativ kurzen Kandidatenliste werden Chromatogramme manuell überprüft.

Alle Hustenproben (10 unfraktionierte, 10 fraktionierte x 3 Probentypen = 60 Proben) werden wie beschrieben einer Proteomanalyse unterzogen.

Kompartimentübergreifende Vergleiche: Die Bestimmung der Hustensurrogat für die Lunge kann analog zu der Bestimmung der EBC-Surrogat für die Lunge durchgeführt werden. Innerhalb einer bestimmten Plattform werden die Ausmaße (und die Signatur) der SMM-Mutation verglichen. In der jüngeren Vergangenheit wurde dies in der ausgeatmeten microRNA-Umgebung (hier nicht vorgeschlagen) durch Spearman-Korrelationen der Clusterung von microRNA-seq-Daten in Hauptkomponenten, PCA (nicht gezeigt) und Spearman-Korrelationen (nicht gezeigt) durchgeführt. Für die Proteomikumgebung kann dieser Ersatz von Husten für Lunge in ähnlicher Weise durch Clustering von Heatmaps, PCA und Methoden wie der Spearman-Korrelation für Husten gezeigt werden.

Ergebnis: Dieser erste Pilottest von Husten als neue Plattform-Bioprobe ist eine pragmatische translationale Arbeit mit hohem Risiko und hohem Ertrag. Wenn dieses Pilotprojekt auf den beiden untersuchten Plattformen zeigt, dass Husten ein gültiger Ersatz für Lunge ist, dann wird dies starke vorläufige Beweise für die Unterstützung weiterer Bundesfinanzierungen liefern. Dieses Potenzial für ein atemwegbasiertes Portal zur Lunge könnte für eine Vielzahl akuter und chronischer klinischer und öffentlicher Gesundheitszwecke in Betracht gezogen werden.