Yskäkaappaus portaalina keuhkoihin (CC1)

Hypoteesi: Yskä voi toimia pätevänä ei-invasiivisena korvikkeena keuhkoissa suurille molekyyleille, kuten DNA:lle ja proteiineille, mahdollisesti erilaisiin kliinisiin ja kansanterveystarkoituksiin.

Ehdotus lyhyesti: Epidemiologisen ja kliinisesti käyttökelpoisen alustan kehittämiseksi suurille molekyyleille, jotka on siepattu ainutlaatuisesti syvistä keuhkoista, tutkijaryhmä noudattaa uutta lähestymistapaa, joka sisältää yskän keräämisen ja yskänäytteiden jakamisen tehokkuuden ja käytännöllisyyden testaamisen syvässä keuhkoissa. spesifiset solunulkoiset rakkulat (EV:t). Tätä yskänäytettä verrataan invasiivisesti kerättyjen syväkeuhkonäytteiden BAL/keuhkoputkien harjauksiin ja mahdolliseen kontaminoivaan suuhuuhteluveteen, kaikki samoista henkilöistä. Tutkimusryhmä ehdottaa aluksi, että nämä raa'at yskänäytteet ja sitten EV-partioidut hengitystienäytteet tutkitaan somaattisten mutaatioiden varalta SMM-bulkkisekvensoinnilla somaattisten mutaatioiden varalta, huipputekniikan tekniikoista, jotka on kehitetty Vijg/Maslovin laboratorioissa ja spesifisten proteiinien varalta. keuhkoihin, toisin kuin suuonteloon/sylkeen, Sidoli/proteomics-ytimessä.

Erityiset tavoitteet:

1. Yskä siepataan ilmakammiolla tai vastaavalla/optimoidulla laitteella viideltä terveeltä vapaaehtoiselta ja viideltä nykyiseltä tupakoitsijalta samanaikaisesti suuveden ja BAL:n kanssa. Keuhkokohtaiset sähkölaitteet näistä samoista näytteistä syvän keuhkojen sieppauksen (Loudig lab) avulla suoritetaan rinnakkain.
2. Yskälle tehdään DNA-mutaatioanalyysit käyttämällä yhden molekyylin mutaatiosekvensointia (SMM-seq).
3. Yskälle, suuvedelle ja BAL:lle tehdään proteominen analyysi käyttämällä LC-MS:ää Core-laitoksessamme.

Lähestyä:

Human Lung Studies -protokollakäytännöt yleensä: Jatkuva tutkimushenkilöiden ilmoittautuminen on osa pitkäaikaista IRB-hyväksyttyä Einstein-Montefioren kliinistä tapauskontrolliprotokollaa (2007-407). Keuhkolääkärin henkilöt, jotka voivat ilmoittautua mukaan, ovat: Ikä > 21 vuotta, mikä tahansa tupakointitila, lukemattomia samanaikaisia ​​​​tilauksia lukuun ottamatta BAL:n vasta-aiheita, jotka on suunniteltu kliinisesti indikoituun keuhkojen keräystoimenpiteeseen (bronkoskopia) osana rutiinihoitoa. Tämä vastaa >100-150 bronkoskopiaa ja siihen liittyviä entisiä tupakoitsijoita luovuttajia vuodessa. Yli 150-200 tällaista olemassa olevaa bronkoskooppista näytesarjaa ja niihin liittyvä ei-invasiivinen EBC sekä MW, bukkaalinen harja ja muut] on talletettu ja mahdollisesti saatavilla nykyiseen tutkimukseen. Kaikki tiedot/näytteet kerätään ennen diagnoosia ja menettelyä; jokainen koehenkilö antaa EBC-näytteitä (ja muita ei-invasiivisia, kuten yskä) näytteitä ennen bronkoskoopiaa. Sellaisenaan tämä aktiivinen protokolla minimoi (i) palautuspoikkeaman; ja ii) ei-invasiivisten näytteiden saastuminen näille keuhkotoimenpiteille ominaisen keuhkokudoksen rikkoutumisen ja vuotamisen seurauksena. Jokaista koehenkilöä seurataan 3 kuukauden ajan sairauskertomuksessa päivitetyn diagnoosin/testauksen keräämiseksi ja tapauskontrollin virheellisen luokituksen minimoimiseksi. Saatavilla on laajat demografiset, altistumis- ja kliiniset tiedot: (1) demografiset tiedot; (2) tupakoinnin yksityiskohdat: (3) taustalla olevan keuhkosairauden merkkiaineet: (4) olemassa oleva kuvantaminen (5) kliiniset tiedot/patologiset löydökset. Tälle ICTR-pilottille:

1. Tavoite 1: Yskä havaitaan viideltä terveeltä vapaaehtoiselta ja viideltä nykyiseltä tupakoitsijalta ennen bronkoskopiaa. Myös tutkimus-BAL- ja suuhuuhtelunäytteitä kerätään. Näistä näytteistä keuhkokohtaiset sähkölaitteet suoritetaan syvän keuhkon sieppauksen (Loudig lab) avulla samanaikaisesti.

Yskä siepataan ilmakammiossa (yleinen, kertakäyttöinen kädessä pidettävä välilaite astmamittarin annosinhalaattoreille/pumpuille). Tutkijaryhmä on havainnut, että se on riittävä yskän (pakotettu uloshengitys) sieppauslaite, joka odottaa lisäoptimointia. Suunnitellun muutoksen mukaan potilasta neuvotaan yskimään 30 sekunnin välein kädessä pidettävään muovikammioon, yhteensä 10 minuutin ajan. Sitten koko kammion kaikki sisäpinnat huuhdellaan 2-4 ml:lla PBS:ää ja huuhtelu/pesu pikapakastetaan. Tämän jälkeen huuhteluaine käsitellään tutkittavan analyytin mukaan. DNA:ta varten on isopropanoli/EtOH-saostusvaihe, jota seuraa uudelleensuspendointi pienemmässä tilavuudessa ja uuttaminen Qiagen/Zymo DNA-eristyssarjalla. Proteiinin osalta PBS:ssä olevaa raakauutetta käsitellään suoraan ytimessä saostamalla, kuivaamalla, uudelleensuspendoimalla puskuriin ja ruiskuttamalla LC-MS-alustaan ​​haulikkoanalyysejä varten.

EV-osiomenettely on julkaistu. EV-CATCHER™ voidaan räätälöidä kohdentamaan ainutlaatuisia pintamembraaniproteiineja, jotka liittyvät halutulle solutyypille ja siten suoraan sieppaamaan soluspesifisiä EV:itä. Loudig-laboratorio on koonnut laajaa tietoa, joka osoittaa esimerkiksi, että käyttämällä vasta-aineita, jotka kohdistuvat syvän keuhkosolujen ainutlaatuisiin ja spesifisiin proteiineihin (esim. Clara Cell Specific Proteiini (CCSP), Alveolaarisen tyypin 2 solun pinta-aktiivinen proteiini-C (SFTPC)) voidaan spesifisesti puhdistaa sähköautoja. bronkoalveolaarisista huuhteluista (BAL) ja uloshengityshengityskondensaateista (EBC) ja saada samanlaiset miRNA-ekspressioprofiilit. Lopuksi lisäämällä entsymaattisesti hajoava urasyloitu kaksijuosteinen biotiinileimattu DNA-linkkeri immobilisoivan alustan (96-kuoppaisen polystyreenilevyn) ja aktivoidun vasta-aineen väliin, immunopuhdistettujen EV:iden ehjä vapautuminen urasiiliglykosylaasin (UNG) kanssa inkuboimalla voidaan helpottaa.

Lähestymistapa: Alikvootit 10 alkuperäisestä luovuttajasta, jotka toimittivat yskä-, suuhuuhtelu- ja BAL-näytteitä (5 nykyistä tupakoitsijaa, 5 ei koskaan tupakoi), yhteensä 30 alkuperäistä näytettä kaikista näytetyypeistä EV-jakoa varten. Sitten luodaan sekä kokonaan osittamattomat että EV-osioidut näytteet (yhteensä 60 näytettä), jotka testataan kahteen päämääritykseen, SMM somaattista mutaatiota varten ja haulikkoproteomiikka, sekä toteutettavuuden esittelyä että sijaissynnytysten pilottiarviointia varten. yskä keuhkoihin.

Tavoite 2: Yskälle tehdään DNA-mutaatioanalyysit käyttämällä SMM:ää. Genomisekvenssin eheyden suora analyysi normaaleissa soluissa. Keskeinen ongelma tutkittaessa genomisekvenssin eheyttä normaaleissa ihmiskudoksissa on DNA-mutaatioiden satunnainen luonne genomissa. Vaikka jotkin mutaatiot monistetaan kloonisesti, suurin osa niistä on ainutlaatuisia kullekin solulle, ja siksi harvinaisia ​​ja muunnelmia, mikä edellyttää joko yhden solun koko genomin monistusta tai in vitro klonaalisten monistusmäärityksiä. Molemmat lähestymistavat on liitetty esineisiin. Hiljattain Maslov/Vijg-laboratorio kehitti luotettavia menetelmiä somaattisten mutaatioiden kvantitatiiviseen arvioimiseen yksittäisissä soluissa tai kloonisesti monistetuissa yksittäisissä soluissa. Näitä menetelmiä käyttämällä osoitettiin, että emässubstituutiomutaatiot lisääntyvät tupakoinnin (ja iän) myötä proksimaalisissa keuhkoputken epiteelin tyvisoluissa. Uudempi menetelmä somaattisten mutaatioiden kvantitatiiviseen analyysiin, SMM-seq (Single Molecule Mutation-seq), on paljon kustannustehokkaampi ja sitä voidaan soveltaa pieniin määriin bulkki-DNA:ta. Tämä uusin SMM-seq-menetelmä on merkittävä, koska se mahdollistaa muun muassa käytännöllisen tavan havaita tarkasti sytologisesti normaaleissa soluissa tapahtuvia mutaatioita.

Lähestymistapa: 20 yskänäytettä (10 fraktioimatonta, 10 fraktioitua) suoritetaan DNA-uutto ja kirjaston valmistelu ja sekvensointi protokollassa kuvatulla tavalla. Somaattiset mutaatiot kaikkien havaittujen varianttien joukossa tapahtuvat vähentämällä ituradan polymorfismit, jotka on löydetty analysoimalla säännöllistä sekvensointikirjastoa saman yksilön DNA:sta. Somaattisten varianttien määrä normalisoidaan kutsuttavien tukien lukumäärään, eli tukikohtiin, joiden peitto on yli 7X SMM-seq-kirjastoissa ja joiden peitto on yli 20X tavallisissa kirjastoissa. Somaattisten mutaatioiden taajuus ilmaistaan ​​mutaatioiden lukumääränä genomia kohti. Loput 40 näytettä (20 suuvedestä ja 20 BAL:sta) käsitellään muissa käynnissä olevissa rahoitusmekanismeissa budjettirajoitusten vuoksi.

Tavoite 3: Yskälle, suuvedelle ja BAL:lle tehdään proteominen analyysi käyttämällä LC-MS:ää Einsteinin ydinlaitoksessa. Aiempia proteomisia yrityksiä yskässä ei ole tutkijaryhmän tietojen mukaan olemassa, johtuen ehkä vähän materiaalin teknisistä rajoituksista. Proteomiikkaydin (Sidoli, et ai.) optimoi strategian lisätäkseen herkkyyttä ja nopeutta vähäisen runsauden proteiinien/peptidien kvantifioinnissa. Näytteen valmistusprotokollaa muutetaan näytehäviön minimoimiseksi ja nanonestekromatografian miniatyyrisoimiseksi yhdistettynä huipputekniikan MS:ään proteiinien/peptidien kvantifioimiseksi BAL-, MW- ja EBC-näytteissä.

Lähestymistapa: Näytteen valmistelu proteomiikkaa varten: Yskänäyte kuivataan loppuun asti ja suspendoidaan sitten uudelleen 5 µl:aan 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH = 8) kanonista proteomiikan näytteen valmistelua varten (20 ng trypsiiniä). Sitten koko näyte analysoidaan käyttämällä Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nanonestekromatografia yhdistettynä online-tilassa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) -massaspektrometriin. Erottelua varten laboratorio käyttää talon sisäistä pakattua analyyttistä kolonnia, jonka sisähalkaisija on minimaalinen (50 µm sisähalkaisija, 25 cm pituus), jotta molekyylit, joiden virtausnopeus on ~100 nL/min, voidaan erottaa. Alhainen virtausnopeus parantaa kolonnista eluoituvan näytteen esipitoisuutta, mikä johtaa subtomoliherkkyyteen.

Tietojen analysointi, mukaan lukien tietojen muuntaminen, suoritetaan sitten käyttämällä putkia Sidolin laboratoriossa. Lyhyesti sanottuna proteomiikan MS-spektrit identifioidaan ja kvantifioidaan käyttämällä Proteome Discovereria (v2.5, Thermo Scientific) tiukemmat kynnykset kuin mitä yhteisö tällä hetkellä suosittelee väärien löytöjen osalta (<1 % FDR spektrin osuville, peptideille ja proteiineille). Sitten kvantitatiiviset arvot muunnetaan ja normalisoidaan Sidolin laboratorion kuvaamalla tavalla. Tilastollista säätelyä arvioidaan parametristen tilastojen avulla (p< 0,05). Kromatogrammit tarkastetaan manuaalisesti, koska ehdokasluettelo on suhteellisen lyhyt.

Kaikille yskänäytteille (10 fraktioimatonta, 10 fraktioitua x 3 näytetyyppiä = 60 näytettä) suoritetaan proteominen analyysi kuvatulla tavalla.

Osaston väliset vertailut: Keuhkojen yskän sijaissynnytys voidaan määrittää samalla tavalla kuin keuhkojen EBC-korjaussynnytys. Tietyllä alustalla verrataan SMM-mutaation tasoja (ja allekirjoituksia). Viime aikoina uloshengitetyssä mikroRNA-ympäristössä (ei ehdotettu tässä), tämä on suoritettu Spearman-korrelaatioilla pääkomponenttien mikroRNA-seq-datan klusteroinnista, PCA (ei esitetty) ja Spearman-korrelaatioista (ei esitetty). Proteomiikkaympäristössä tämä yskän sijaissynnytys keuhkoille voidaan osoittaa yskälle samalla tavalla klusteroimalla lämpökartat, PCA ja menetelmät, kuten Spearman-korrelaatio.

Tulos: Tämä yskän ensimmäinen pilottitestaus uuden alustan bionäytteenä on korkean riskin ja korkean palkitsemisen käytännönläheinen translaatiotyö. Jos tämä pilottihanke osoittaa, että yskä on kelvollinen korvike keuhkoille kahdella tutkitulla alustalla, se tarjoaa vahvaa alustavaa näyttöä liittovaltion lisärahoituksen tukemisesta. Tämä potentiaali hengitysteihin perustuvalle portaalille keuhkoihin voitaisiin kuvitella monenlaisiin akuutteihin ja kroonisiin kliinisiin ja kansanterveystarkoituksiin.