Cattura della tosse come portale nel polmone (CC1)

Ipotesi: la tosse può servire come valido surrogato non invasivo del polmone per grandi molecole come il DNA e le proteine, potenzialmente per una varietà di scopi clinici e di salute pubblica.

Proposta in breve: per lo sviluppo di una piattaforma epidemiologica e clinicamente applicabile per grandi molecole catturate in modo univoco dal polmone profondo, il team di ricercatori perseguirà un nuovo approccio che include la raccolta della tosse e il test dell'efficacia e della praticità del partizionamento del campione di tosse per il polmone profondo specifiche vescicole extracellulari (EV). Questo campione di tosse verrà confrontato con quello prelevato in modo invasivo da campioni polmonari profondi BAL/spazzolature bronchiali e con il collutorio potenzialmente contaminante, tutti provenienti dagli stessi individui. Il team di studio propone inizialmente di esaminare questi campioni grezzi di tosse, e quindi campioni di vie aeree partizionati EV, per mutazioni somatiche mediante sequenziamento di massa SMM per mutazioni somatiche, tecniche all'avanguardia sviluppate nei laboratori Vijg/Maslov e per proteine ​​note per essere specifiche per polmone, al contrario di cavità orale/saliva, nel nucleo di Sidoli/proteomica.

Obiettivi specifici:

1. La tosse sarà catturata da aerocamera o dispositivo equivalente/ottimizzato in 5 volontari sani e in 5 fumatori attuali, in parallelo con collutorio e con BAL. EV specifici del polmone da questi stessi campioni tramite cattura polmonare profonda (laboratorio Loudig) saranno eseguiti in parallelo.
2. La tosse sarà sottoposta ad analisi di mutazione del DNA utilizzando il sequenziamento della mutazione di una singola molecola (SMM-seq).
3. Tosse, collutorio e BAL saranno sottoposti ad analisi proteomica utilizzando LC-MS nella nostra struttura Core.

Approccio:

Pratiche del protocollo Human Lung Studies, in generale: l'arruolamento in corso dei soggetti fa parte di un protocollo clinico caso-controllo Einstein-Montefiore di lunga data approvato dall'IRB (2007-407). Gli individui provenienti da pratiche polmonari idonei all'arruolamento sono: Età> 21 anni, qualsiasi stato di fumo, una miriade di stati di comorbilità eccetto controindicazioni al BAL, pianificato per procedura di prelievo polmonare clinicamente indicata (broncoscopia) come parte delle cure di routine. Ciò equivale a >100-150 broncoscopia e relative reclute di ex donatori fumatori all'anno. Oltre 150-200 di questi set di campioni broncoscopici preesistenti e il relativo EBC non invasivo, insieme a MW, pennello buccale, altri] sono in banca e potenzialmente disponibili per lo studio attuale. Tutti i dati/campioni vengono raccolti pre-diagnosi e pre-procedura; ogni soggetto fornisce campioni di EBC (e altri metodi non invasivi come la tosse) prima della broncoscopia. In quanto tale, questo protocollo attivo riduce al minimo (i) bias di richiamo; e (ii) contaminazione di campioni non invasivi a causa di rotture e fuoriuscite di tessuto polmonare inerenti a queste procedure polmonari. Ogni soggetto sarà seguito per 3 mesi nella cartella clinica per raccogliere diagnosi/test aggiornati e ridurre al minimo l'errata classificazione caso-controllo. Sono disponibili ampi dati demografici, sull'esposizione e clinici: (1) informazioni demografiche; (2) dettagli sul fumo: (3) marcatori di malattie polmonari sottostanti: (4) immagini esistenti (5) informazioni cliniche/reperti patologici. Per questo pilota ICTR:

1. Obiettivo 1: La tosse verrà catturata in 5 volontari sani e in 5 fumatori attuali prima di sottoporsi a broncoscopia. Saranno raccolti anche campioni di BAL di ricerca e collutori. EV specifici del polmone da questi campioni tramite cattura polmonare profonda (laboratorio Loudig) saranno eseguiti in parallelo.

La tosse verrà catturata nell'aerocamera (dispositivo distanziatore manuale usa e getta comune per inalatori/pompe per dosaggi per l'asma). Il team di investigatori ha scoperto che si tratta di un dispositivo di cattura della tosse (espirazione forzata) adeguato, in attesa di ulteriore ottimizzazione. In base a un emendamento pianificato, al paziente viene chiesto di tossire ogni 30 secondi nella camera di plastica portatile, per un periodo complessivo di 10 minuti. Tutte le superfici interne dell'intera camera vengono quindi risciacquate con 2-4 ml di PBS e il risciacquo/lavaggio viene congelato a scatto. Il risciacquo viene successivamente elaborato in base all'analita da studiare. Per il DNA, è prevista una fase di precipitazione con isopropanolo/EtOH, seguita dalla risospensione in un volume minore e dall'estrazione con il kit di isolamento del DNA Qiagen/Zymo. Per le proteine, l'estratto grezzo in PBS viene gestito direttamente nel nucleo mediante precipitazione, essiccamento, risospensione in tampone e iniezione nella piattaforma LC-MS per analisi shotgun.

Viene pubblicata la procedura di partizionamento EV. EV-CATCHER™ può essere personalizzato per mirare a proteine ​​di membrana di superficie uniche specifiche per il tipo di cellula desiderato e quindi per catturare direttamente EV specifici per cellula. Il laboratorio di Loudig ha raccolto dati estesi che dimostrano, ad esempio, che l'uso di anticorpi mirati a proteine ​​​​uniche e specifiche delle cellule polmonari profonde (ad es., Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) può purificare in modo specifico gli EV dai lavaggi broncoalveolari (BAL) e dai condensati del respiro esalato (EBC) e ottenere profili di espressione di miRNA simili. Infine, aggiungendo un DNA linker uracilato a doppio filamento marcato con biotina enzimaticamente degradabile tra la piattaforma immobilizzante (piastra a 96 pozzetti di polistirene) e l'anticorpo attivato, è possibile facilitare il rilascio intatto di EV immunopurificati mediante incubazione con uracil glicosilasi (UNG).

Approccio: aliquote dei 10 donatori iniziali che forniscono campioni di tosse, collutorio e BAL (5 fumatori attuali, 5 non fumatori) per un totale di 30 campioni iniziali tra tutti i tipi di campioni per la partizione EV. Quindi, verranno generati campioni interi non partizionati e partizionati EV (per un totale di 60 campioni) da analizzare per i due saggi principali, SMM per mutazione somatica e proteomica shotgun, entrambi per dimostrazione di fattibilità e valutazione pilota della surrogazione di tosse per polmone.

Obiettivo 2: La tosse sarà sottoposta ad analisi di mutazione del DNA mediante SMM. Analisi diretta dell'integrità della sequenza del genoma nelle cellule normali. Un problema chiave nello studio dell'integrità della sequenza del genoma nei normali tessuti umani è la natura casuale delle mutazioni del DNA nel genoma. Mentre alcune mutazioni sono amplificate clonalmente, la stragrande maggioranza è unica per ogni cellula, e quindi rara e variante, che richiede l'amplificazione dell'intero genoma di una singola cellula o saggi di amplificazione clonale in vitro. Entrambi gli approcci sono stati associati agli artefatti. Recentemente, il laboratorio Maslov/Vijg ha sviluppato metodi affidabili per valutare quantitativamente le mutazioni somatiche in singole cellule o in singole cellule amplificate clonalmente. Utilizzando questi metodi è stato dimostrato che le mutazioni di sostituzione di base aumentano con il fumo (e l'età) nelle cellule basali epiteliali bronchiali prossimali. Un nuovo metodo per l'analisi quantitativa delle mutazioni somatiche, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), è molto più conveniente e può essere applicato a piccole quantità di DNA sfuso. Questo ultimo metodo SMM-seq è significativo perché consente, tra le altre considerazioni, un mezzo pratico per rilevare con precisione le mutazioni nelle cellule citologicamente normali.

Approccio: i 20 campioni di tosse (10 non frazionati, 10 frazionati) saranno sottoposti a estrazione del DNA, preparazione della libreria e sequenziamento come descritto nel protocollo. Le mutazioni somatiche tra tutte le varianti rilevate si verificano per sottrazione dei polimorfismi della linea germinale trovati dall'analisi della libreria di sequenziamento regolare dal DNA dello stesso individuo. Il numero di varianti somatiche è normalizzato al numero di basi richiamabili, ovvero basi con copertura superiore a 7 volte nelle librerie SMM-seq e con copertura superiore a 20 volte nelle librerie regolari. La frequenza delle mutazioni somatiche sarà espressa come numero di mutazioni per genoma. I restanti 40 campioni (20 dal collutorio e 20 dal BAL) saranno elaborati nell'ambito di altri meccanismi di finanziamento in corso, dati i vincoli di bilancio.

Obiettivo 3: Tosse, collutorio e BAL saranno sottoposti ad analisi proteomica utilizzando LC-MS nella struttura Core di Einstein. A conoscenza del team di investigatori, non esistono precedenti tentativi di proteomica nella tosse, forse a causa delle limitazioni tecniche del materiale a bassa abbondanza. Il nucleo di proteomica (Sidoli, et al) ottimizzerà una strategia per migliorare la sensibilità e la velocità per quantificare proteine/peptidi a bassa abbondanza. Il protocollo di preparazione del campione sarà modificato per ridurre al minimo la perdita di campione e miniaturizzare la cromatografia nano-liquida accoppiata con MS all'avanguardia per quantificare proteine/peptidi in campioni di BAL, MW ed EBC.

Approccio: Preparazione del campione per la proteomica: il campione per la tosse viene asciugato fino al completamento e quindi risospeso in 5 µL di bicarbonato di ammonio 50 mM (pH = 8) per la preparazione del campione di proteomica canonica (20 ng di tripsina). L'intero campione viene quindi analizzato utilizzando un cromatografo nano-liquido Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) accoppiato online con uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Per la separazione, il laboratorio utilizzerà una colonna analitica impaccata interna con diametro interno minimo (50 µm ID, 25 cm di lunghezza) in modo da poter separare le molecole con una portata di ~ 100 nL/min. La bassa velocità di flusso fornisce una maggiore pre-concentrazione del campione che eluisce dalla colonna, determinando una sensibilità subattomolecolare.

L'analisi dei dati, inclusa la trasformazione dei dati, viene quindi eseguita utilizzando una pipeline nel laboratorio di Sidoli. In breve, gli spettri proteomici MS vengono identificati e quantificati utilizzando Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) con soglie più rigorose di quelle attualmente raccomandate dalla comunità per il tasso di false scoperte (<1% FDR per corrispondenze di spettro, peptidi e proteine). I valori quantitativi vengono poi trasformati e normalizzati come descritto dal laboratorio Sidoli. La regolazione statistica viene valutata utilizzando statistiche parametriche (p<0,05). I cromatogrammi vengono ispezionati manualmente, dato l'elenco relativamente breve di candidati.

Tutti i campioni di tosse (10 tipi di campioni non frazionati, 10 frazionati x 3 = 60 campioni) saranno sottoposti ad analisi proteomica come descritto.

Confronti tra compartimenti: la determinazione della surrogazione della tosse per il polmone può essere eseguita in modo analogo a quella eseguita per la surrogazione dell'EBC per il polmone. All'interno di una data piattaforma, verranno confrontati i livelli (e la firma) della mutazione SMM. Nel recente passato nell'ambiente del microRNA esalato (non proposto qui), ciò è stato eseguito dalle correlazioni di Spearman del raggruppamento di dati microRNA-seq nei componenti principali, PCA (non mostrato) e correlazioni di Spearman (non mostrato). Per l'ambiente proteomico, questa surrogata della tosse per il polmone può essere mostrata per la tosse in modo simile raggruppando mappe di calore, PCA e metodi come la correlazione di Spearman.

Risultato: questo test pilota iniziale sulla tosse come nuovo campione biologico di piattaforma è un lavoro traslazionale pragmatico ad alto rischio e ad alta ricompensa. Se questo progetto pilota dimostra che la tosse è un valido surrogato del polmone, sulle due piattaforme esaminate, ciò fornirà solide prove preliminari per sostenere ulteriori finanziamenti federali. Questo potenziale per un portale basato sulle vie aeree al polmone potrebbe essere previsto per un'ampia varietà di scopi clinici e di salute pubblica acuti e cronici.