Hosta fånga som en portal in i lungan (CC1)

Hypotes: Hosta kan fungera som ett giltigt icke-invasivt surrogat för lungan för stora molekyler som DNA och proteiner, potentiellt för en mängd olika kliniska och folkhälsoändamål.

Förslag i korthet: För utveckling av en epidemiologisk och kliniskt användbar plattform för stora molekyler som fångas unikt från djupa lungor, kommer forskarteamet att fortsätta med ett nytt tillvägagångssätt som inkluderar hostinsamling och testning av effektiviteten och praktiska fördelningen av hostprover för djupa lungor. specifika extracellulära vesiklar (EV). Detta hostprov kommer att jämföras med det från invasivt insamlade djupa lungprover BAL/bronkialborstning, och med potentiellt kontaminerande munskölj, allt från samma individer. Studiegruppen föreslår initialt att undersöka dessa råa hostprover, och sedan EV-partitionerade luftvägsprover, för somatiska mutationer genom SMM-bulksekvensering för somatiska mutationer, toppmoderna tekniker utvecklade i Vijg/Maslov-laboratoriet och för proteiner som är kända för att vara specifika för lunga, i motsats till munhåla/saliv, i Sidoli/proteomikkärnan.

Specifika mål:

1. Hosta kommer att fångas upp av aerochamber eller motsvarande/optimerad enhet hos 5 friska frivilliga och hos 5 nuvarande rökare, parallellt med munsköljning och med BAL. Lungspecifika elbilar från samma prover via djup lunginfångning (Loudig lab) kommer att utföras parallellt.
2. Hosta kommer att genomgå DNA-mutationsanalyser med användning av mutationssekvensering av en enda molekyl (SMM-seq).
3. Hosta, munvatten och BAL kommer att genomgå proteomanalys med LC-MS i vår Core-anläggning.

Närma sig:

Human Lung Studies protokollpraxis, i allmänhet: Pågående ämnesregistrering är en del av ett långvarigt IRB-godkänt Einstein-Montefiore-protokoll för klinisk fallkontroll (2007-407). Individer från lungkliniker som är berättigade att anmäla sig är: Ålder > 21 år, alla rökstatus, otaliga komorbida statusar förutom kontraindikationer mot BAL, planerade för kliniskt indikerade lunginsamlingsprocedur (bronkoskopi) som en del av rutinvård. Detta uppgår till >100-150 bronkoskopi och relaterade tidigare rökdonatorrekryterar per år. Över 150-200 sådana redan existerande bronkoskopiska provuppsättningar, och åtföljande icke-invasiv EBC, tillsammans med MW, buckal borste, andra] finns samlade och potentiellt tillgängliga för den aktuella studien. Alla data/prover samlas in före diagnos och pre-procedur; varje försöksperson ger EBC-prover (och andra icke-invasiva såsom hosta) prover före bronkoskopi. Som sådant minimerar detta aktiva protokoll (i) återkallningsbias; och (ii) kontaminering av icke-invasiva prover från störningar och spill av lungvävnaden som är inneboende i dessa lungprocedurer. Varje försöksperson kommer att följas under 3 månader i journalen för att samla uppdaterad diagnostik/testning och minimera felklassificering av fallkontroll. Omfattande demografiska, exponerings- och kliniska data finns tillgängliga: (1) demografisk information; (2) information om rökning: (3) markörer för underliggande lungsjukdom: (4) befintlig bildbehandling (5) klinisk information/patologiska fynd. För denna ICTR-pilot:

1. Mål 1: Hosta kommer att fångas upp hos 5 friska frivilliga och hos 5 nuvarande rökare innan de genomgår bronkoskopi. Forsknings-BAL och munsköljprover kommer också att samlas in. Lungspecifika elbilar från dessa prover via djup lunginfångning (Loudig lab) kommer att utföras parallellt.

Hosta kommer att fångas upp i aerochamber (vanlig, engångshandhållen distansanordning för astmamätardosinhalatorer/pumpar). Utredarteamet har funnit att det är en adekvat hosta (tvingad utandning) fångstanordning, i väntan på ytterligare optimering. Enligt en planerad ändring instrueras patienten att hosta var 30:e sekund in i den handhållna plastkammaren, under en total period av 10 minuter. Alla invändiga ytor av hela kammaren sköljs sedan med 2-4 ml PBS, och sköljningen/tvättningen snabbfryses. Sköljningen behandlas därefter i enlighet med den analyt som ska studeras. För DNA finns ett isopropanol/EtOH-utfällningssteg, följt av resuspension i mindre volym och extraktion med Qiagen/Zymo DNA-isoleringskit. För protein hanteras råextraktet i PBS direkt i kärnan genom utfällning, torkning, resuspension i buffert och injektion i LC-MS-plattformen för hagelgevärsanalyser.

EV-partitioneringsproceduren publiceras. EV-CATCHER™ kan anpassas för att rikta in sig på unika ytmembranproteiner speciellt för den önskade celltypen och därmed för att styra infångningen av cellspecifika elbilar. Loudig-labbet har sammanställt omfattande data som till exempel visar att användning av antikroppar som riktar in sig på unika och specifika proteiner i djupa lungceller (t.ex. Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar typ 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) kan specifikt rena elbilar från bronkoalveolära sköljningar (BAL) och utandningskondensat (EBC) och få liknande miRNA-expressionsprofiler. Slutligen, genom att lägga till en enzymatiskt nedbrytbar uracylerad dubbelsträngad biotinmärkt DNA-linker mellan immobiliserande plattform (polystyrenplatta med 96 brunnar) och den aktiverade antikroppen, kan den intakta frisättningen av immunrenade EV:er genom inkubation med uracilglykosylas (UNG) underlättas.

Tillvägagångssätt: Alikvoter från de 10 initiala donatorerna som tillhandahåller host-, munskölj- och BAL-prover (5 nuvarande rökare, 5 som röker aldrig) med totalt 30 initiala prover bland alla provtyper för EV-uppdelning. Sedan kommer både hel-opartitionerade och EV-partitionerade prover att genereras (totalt 60 prover) för att triageras till de två huvudanalyserna, SMM för somatisk mutation, och hagelgevärsproteomik, nedan, både för demonstration av genomförbarhet och pilotutvärdering av surrogatmoderskap av hosta för lungan.

Mål 2: Hosta kommer att genomgå DNA-mutationsanalyser med SMM. Direkt analys av genomsekvensintegritet i normala celler. Ett nyckelproblem vid studier av genomsekvensintegritet i normala mänskliga vävnader är den slumpmässiga naturen hos DNA-mutationer i genomet. Medan vissa mutationer amplifieras klonalt, är de allra flesta unika för varje cell, och därför sällsynta och varianter, vilket kräver antingen amplifiering av en encells helgenom eller in vitro klonala amplifieringsanalyser. Båda tillvägagångssätten har förknippats med artefakter. Nyligen utvecklade Maslov/Vijg-labbet pålitliga metoder för att kvantitativt bedöma somatiska mutationer i enstaka celler eller i klonalt förstärkta enstaka celler. Med användning av dessa metoder visades det att bassubstitutionsmutationer ökar med rökning (och ålder) i proximala bronkiala epitelial basalceller. En nyare metod för kvantitativ analys av somatiska mutationer, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), är mycket mer kostnadseffektiv och kan appliceras på små mängder bulk-DNA. Denna senaste SMM-seq-metod är betydelsefull eftersom den bland annat tillåter ett praktiskt sätt att noggrant detektera mutationer i cytologiskt normala celler.

Tillvägagångssätt: De 20 hostproverna (10 ofraktionerade, 10 fraktionerade) kommer att genomgå DNA-extraktion och biblioteksberedning och sekvensering enligt beskrivningen i protokollet. Somatiska mutationer bland alla detekterade varianter sker genom subtraktion av könslinjepolymorfismer som hittats genom analys av regelbundna sekvenseringsbibliotek från DNA från samma individ. Antalet somatiska varianter är normaliserat till antalet anropbara baser, det vill säga baser med täckning mer än 7X i SMM-seq-bibliotek och med täckning mer än 20X i vanliga bibliotek. Somatisk mutationsfrekvens kommer att uttryckas som ett antal mutationer per genom. De återstående 40 proverna (20 från munvatten och 20 från BAL) kommer att behandlas under andra pågående finansieringsmekanismer, med tanke på budgetrestriktioner.

Mål 3: Hosta, munvatten och BAL kommer att genomgå proteomisk analys med LC-MS i Einsteins Core-anläggning. Tidigare proteomikförsök vid hosta existerar inte såvitt forskarteamet känner till, kanske på grund av tekniska begränsningar av material med låg förekomst. Proteomikkärnan (Sidoli, et al) kommer att optimera en strategi för att öka känsligheten och hastigheten för att kvantifiera proteiner/peptider med låg förekomst. Provberedningsprotokollet kommer att modifieras för att minimera provförlusten och miniatyrisera nano-vätskekromatografi tillsammans med toppmodern MS för att kvantifiera proteiner/peptider i BAL-, MW- och EBC-prover.

Tillvägagångssätt: Provberedning för proteomik: Hostprovet torkas till slut och återsuspenderas sedan i 5 µL 50 mM ammoniumbikarbonat (pH = 8) för kanonisk proteomikprovberedning (20 ng trypsin). Hela provet analyseras sedan med en Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nano-vätskekromatograf kopplad online med en Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) masspektrometer. För separation kommer labbet att använda en intern packad analytisk kolonn med minimal innerdiameter (50 µm ID, 25 cm längd) så att molekyler med en ~100 nL/min flödeshastighet kan separeras. Den låga flödeshastigheten ger förbättrad förkoncentration av provet som eluerar från kolonnen, vilket leder till sub-atomolkänslighet.

Dataanalys, inklusive datatransformation, utförs sedan med hjälp av en pipeline i Sidoli-labbet. Kortfattat identifieras och kvantifieras proteomics MS-spektra med Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) med strängare trösklar än vad som för närvarande rekommenderas av gemenskapen för falsk upptäcktsfrekvens (<1 % FDR för spektrummatchningar, peptider och proteiner). Kvantitativa värden transformeras sedan och normaliseras enligt beskrivningen av Sidoli-labbet. Statistisk reglering bedöms med hjälp av parametrisk statistik (p<0,05). Kromatogram inspekteras manuellt, med tanke på den relativt korta listan med kandidater.

Alla hostprover (10 ofraktionerade, 10 fraktionerade x 3 provtyper=60 prover) kommer att genomgå proteomanalys enligt beskrivningen.

Jämförelser mellan avdelningar: Bestämning av hosta surrogatmoderskap för lunga kan utföras på samma sätt som det som utförs för EBC surrogatmödraskap för lungan. Inom en given plattform kommer nivåerna (och signaturen) av SMM-mutation att jämföras. Under det senaste förflutna i utandad mikroRNA-miljö (ej föreslagen här), har detta utförts av Spearman-korrelationer av mikroRNA-seq-dataklustring i huvudkomponenter, PCA (ej visat) och Spearman-korrelationer (ej visat). För proteomikmiljön kan detta surrogatmoderskap av hosta för lung visas för hosta på liknande sätt genom att gruppera värmekartor, PCA och metoder som Spearman-korrelation.

Resultat: Denna första pilottestning av hosta som ett nytt plattformsbioprov är ett pragmatiskt translationsarbete med hög risk och hög belöning. Om detta pilotprojekt visar att hosta är ett giltigt surrogat för lungor, på de två undersökta plattformarna, kommer det att ge starka preliminära bevis för att stödja ytterligare federal finansiering. Denna potential för en luftvägsbaserad portal till lungan skulle kunna tänkas för en mängd olika akuta och kroniska kliniska och folkhälsoändamål.