Capture de la toux comme portail dans les poumons (CC1)

Hypothèse : La toux peut servir de substitut non invasif valide pour le poumon pour les grosses molécules telles que l'ADN et les protéines, potentiellement à diverses fins cliniques et de santé publique.

Proposition en bref : Pour le développement d'une plate-forme épidémiologique et cliniquement applicable pour les grandes molécules capturées uniquement dans les poumons profonds, l'équipe de chercheurs poursuivra une nouvelle approche qui comprend la collecte de la toux et testera l'efficacité et la praticité du partitionnement des échantillons de toux pour les poumons profonds. des vésicules extra-cellulaires (VE) spécifiques. Cet échantillon de toux sera comparé à celui d'échantillons de poumons profonds prélevés de manière invasive, de brossages BAL/bronchiques, et au rince-bouche potentiellement contaminant, tous provenant des mêmes individus. L'équipe d'étude propose initialement d'examiner ces échantillons bruts de toux, puis des échantillons de voies respiratoires partitionnés par EV, pour les mutations somatiques par séquençage en masse SMM pour les mutations somatiques, les techniques de pointe développées dans les laboratoires Vijg/Maslov et pour les protéines connues pour être spécifiques pour le poumon, par opposition à la cavité buccale/la salive, dans le noyau Sidoli/protéomique.

Objectifs spécifiques :

1. La toux sera capturée par aérochambre ou dispositif équivalent/optimisé chez 5 volontaires sains, et chez 5 fumeurs actuels, en parallèle avec les bains de bouche et avec le BAL. Des VE spécifiques aux poumons à partir de ces mêmes échantillons via une capture pulmonaire profonde (laboratoire Loudig) seront réalisées en parallèle.
2. La toux subira des analyses de mutation de l'ADN à l'aide du séquençage de mutation d'une seule molécule (SMM-seq).
3. La toux, les bains de bouche et le BAL subiront une analyse protéomique par LC-MS dans notre installation centrale.

Approche:

Pratiques du protocole des études pulmonaires humaines, en général : le recrutement continu des sujets fait partie d'un protocole clinique de contrôle des cas Einstein-Montefiore approuvé de longue date par l'IRB (2007-407). Les personnes des pratiques pulmonaires éligibles pour s'inscrire sont : Âge> 21 ans, tout statut tabagique, une myriade de comorbidités à l'exception des contre-indications au BAL, prévues pour une procédure de prélèvement pulmonaire cliniquement indiquée (bronchoscopie) dans le cadre des soins de routine. Cela équivaut à plus de 100 à 150 recrues en bronchoscopie et anciens donneurs fumeurs apparentés par an. Plus de 150 à 200 de ces ensembles d'échantillons bronchoscopiques préexistants et EBC non invasif associé, ainsi que MW, brosse buccale, autres] sont mis en banque et potentiellement disponibles pour l'étude en cours. Toutes les données/échantillons sont collectés avant le diagnostic et avant la procédure ; chaque sujet fournit des échantillons d'EBC (et d'autres non invasifs tels que la toux) avant la bronchoscopie. En tant que tel, ce protocole actif minimise (i) le biais de rappel ; et (ii) la contamination d'échantillons non invasifs par les perturbations et le déversement du tissu pulmonaire inhérents à ces procédures pulmonaires. Chaque sujet sera suivi pendant 3 mois dans le dossier médical pour recueillir des diagnostics/tests mis à jour et minimiser les erreurs de classification des cas-témoins. De nombreuses données démographiques, d'exposition et cliniques sont disponibles : (1) informations démographiques ; (2) détails sur le tabagisme : (3) marqueurs de maladie pulmonaire sous-jacente : (4) imagerie existante (5) informations cliniques/constatations pathologiques. Pour ce pilote du TPIR :

1. Objectif 1 : La toux sera détectée chez 5 volontaires sains et chez 5 fumeurs actuels avant de subir une bronchoscopie. Des échantillons de BAL de recherche et de bains de bouche seront également collectés. Des VE spécifiques aux poumons à partir de ces échantillons via une capture pulmonaire profonde (laboratoire Loudig) seront réalisées en parallèle.

La toux sera capturée dans l'aérochambre (dispositif d'espacement portatif jetable commun pour les inhalateurs/pompes doseurs d'asthme). L'équipe d'enquêteurs a découvert qu'il s'agissait d'un dispositif de capture de la toux (expiration forcée) adéquat, en attendant une optimisation plus poussée. En vertu d'un amendement prévu, le patient est invité à tousser toutes les 30 secondes dans la chambre en plastique portable, pendant une période globale de 10 minutes. Toutes les surfaces intérieures de la chambre entière sont ensuite rincées avec 2 à 4 ml de PBS, et le rinçage/lavage est congelé instantanément. Le rinçage est ensuite traité en fonction de l'analyte à étudier. Pour l'ADN, il y a une étape de précipitation à l'isopropanol/EtOH, suivie d'une remise en suspension dans un plus petit volume et d'une extraction par le kit d'isolement d'ADN Qiagen/Zymo. Pour les protéines, l'extrait brut en PBS est manipulé directement dans la carotte par précipitation, séchage, remise en suspension dans du tampon et injection dans la plate-forme LC-MS pour analyses en shotgun.

La procédure de partitionnement EV est publiée. EV-CATCHER™ peut être personnalisé pour cibler des protéines membranaires de surface uniques propres au type de cellule souhaité et ainsi diriger la capture des véhicules électriques spécifiques aux cellules. Le laboratoire Loudig a compilé de nombreuses données démontrant, par exemple, que l'utilisation d'anticorps ciblant des protéines uniques et spécifiques des cellules pulmonaires profondes (par exemple, Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) peut purifier spécifiquement les véhicules électriques. à partir de lavages bronchoalvéolaires (BAL) et de condensats d'haleine expirée (EBC) et obtenir des profils d'expression de miARN similaires. Enfin, en ajoutant un lieur d'ADN marqué à la biotine double brin uracylé dégradable par voie enzymatique entre la plate-forme d'immobilisation (plaque à 96 puits en polystyrène) et l'anticorps activé, la libération intacte des véhicules électriques immunopurifiés par incubation avec l'uracile glycosylase (UNG) peut être facilitée.

Approche : Aliquotes des 10 donneurs initiaux fournissant des échantillons de toux, de rince-bouche et de BAL (5 fumeurs actuels, 5 jamais fumeurs) totalisant 30 échantillons initiaux parmi tous les types d'échantillons pour le partitionnement EV. Ensuite, des échantillons entiers non partitionnés et partitionnés par EV seront générés (totalisant 60 échantillons) pour être triés vers les deux tests principaux, SMM pour la mutation somatique et la protéomique du fusil de chasse, ci-dessous, à la fois pour la démonstration de faisabilité et l'évaluation pilote de la maternité de substitution de toux pour le poumon.

Objectif 2 : La toux subira des analyses de mutation de l'ADN à l'aide de SMM. Analyse directe de l'intégrité de la séquence du génome dans les cellules normales. Un problème clé dans l'étude de l'intégrité de la séquence du génome dans les tissus humains normaux est la nature aléatoire des mutations de l'ADN dans le génome. Alors que certaines mutations sont amplifiées par clonage, la grande majorité sont uniques à chaque cellule, et donc rares et variantes, ce qui nécessite soit une amplification du génome entier unicellulaire, soit des essais d'amplification clonale in vitro. Les deux approches ont été associées à des artefacts. Récemment, le laboratoire Maslov/Vijg a développé des méthodes fiables pour évaluer quantitativement les mutations somatiques dans des cellules individuelles ou dans des cellules individuelles amplifiées par clonage. En utilisant ces méthodes, il a été démontré que les mutations de substitution de bases augmentent avec le tabagisme (et l'âge) dans les cellules basales épithéliales bronchiques proximales. Une méthode plus récente pour l'analyse quantitative des mutations somatiques, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), est beaucoup plus rentable et peut être appliquée à de petites quantités d'ADN en vrac. Cette dernière méthode SMM-seq est importante car elle permet, entre autres considérations, un moyen pratique de détecter avec précision des mutations dans des cellules cytologiquement normales.

Approche : Les 20 échantillons de toux (10 non fractionnés, 10 fractionnés) feront l'objet d'une extraction d'ADN, d'une préparation de bibliothèque et d'un séquençage comme décrit dans le protocole. Les mutations somatiques parmi toutes les variantes détectées se produisent par soustraction des polymorphismes germinaux trouvés par analyse de la bibliothèque de séquençage régulière de l'ADN du même individu. Le nombre de variantes somatiques est normalisé au nombre de bases appelables, c'est-à-dire les bases avec une couverture supérieure à 7X dans les bibliothèques SMM-seq et avec une couverture supérieure à 20X dans les bibliothèques régulières. La fréquence des mutations somatiques sera exprimée en nombre de mutations par génome. Les 40 échantillons restants (20 de rince-bouche et 20 de BAL) seront traités dans le cadre d'autres mécanismes de financement en cours, compte tenu des contraintes budgétaires.

Objectif 3 : la toux, les bains de bouche et le LBA feront l'objet d'une analyse protéomique par LC-MS dans l'installation centrale d'Einstein. Les tentatives antérieures de protéomique dans la toux n'existent pas à la connaissance de l'équipe de chercheurs, peut-être en raison des limitations techniques du matériel à faible abondance. Le noyau protéomique (Sidoli, et al) optimisera une stratégie pour améliorer la sensibilité et la vitesse de quantification des protéines/peptides à faible abondance. Le protocole de préparation des échantillons sera modifié pour minimiser la perte d'échantillons et miniaturiser la chromatographie nano-liquide couplée à une MS de pointe pour quantifier les protéines/peptides dans les échantillons BAL, MW et EBC.

Approche : Préparation de l'échantillon pour la protéomique : L'échantillon de toux est séché jusqu'à la fin, puis remis en suspension dans 5 µL de bicarbonate d'ammonium 50 mM (pH = 8) pour la préparation de l'échantillon de protéomique canonique (20 ng de trypsine). L'ensemble de l'échantillon est ensuite analysé à l'aide d'un chromatographe nano-liquide Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) couplé en ligne à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Pour la séparation, le laboratoire utilisera une colonne analytique garnie interne avec un diamètre interne minimal (50 µm ID, 25 cm de longueur) afin que les molécules avec un débit d'environ 100 nL/min puissent être séparées. Le faible débit fournit une pré-concentration améliorée de l'échantillon éluant de la colonne, conduisant à une sensibilité inférieure à l'attomole.

L'analyse des données, y compris la transformation des données, est ensuite effectuée à l'aide d'un pipeline dans le laboratoire Sidoli. En bref, les spectres MS protéomiques sont identifiés et quantifiés à l'aide de Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) avec des seuils plus stricts que ceux actuellement recommandés par la communauté pour le taux de fausses découvertes (<1 % FDR pour les correspondances de spectre, les peptides et les protéines). Les valeurs quantitatives sont ensuite transformées et normalisées comme décrit par le laboratoire Sidoli. La régulation statistique est évaluée à l'aide de statistiques paramétriques (p < 0,05). Les chromatogrammes sont inspectés manuellement, compte tenu de la liste relativement courte des candidats.

Tous les échantillons de toux (10 non fractionnés, 10 fractionnés x 3 types d'échantillons = 60 échantillons) subiront une analyse protéomique comme décrit.

Comparaisons inter-compartiments : la détermination de la substitution de la toux pour le poumon peut être effectuée de manière analogue à celle effectuée pour la substitution EBC pour le poumon. Au sein d'une plateforme donnée, les niveaux (et la signature) de mutation SMM seront comparés. Dans un passé récent, dans l'environnement de microARN exhalé (non proposé ici), cela a été réalisé par des corrélations de Spearman de regroupement de données de microARN-seq dans les principaux composants, PCA (non illustré) et corrélations de Spearman (non illustré). Pour l'environnement protéomique, cette substitution de la toux pour le poumon peut être démontrée pour la toux de la même manière en regroupant les cartes thermiques, l'ACP et des méthodes telles que la corrélation de Spearman.

Résultat : Ce test pilote initial de la toux en tant que nouvel échantillon biologique de plate-forme est un travail de traduction pragmatique à haut risque et à haute récompense. Si ce projet pilote montre que la toux est un substitut valable du poumon, sur les deux plates-formes examinées, cela fournira des preuves préliminaires solides pour soutenir un financement fédéral supplémentaire. Ce potentiel d'un portail basé sur les voies respiratoires vers le poumon pourrait être envisagé pour une grande variété d'objectifs cliniques et de santé publique aigus et chroniques.