咳嗽捕获作为进入肺部的入口 (CC1)

假设：咳嗽可以作为肺部大分子（如 DNA 和蛋白质）的有效非侵入性替代物，可能用于各种临床和公共卫生目的。

提案简介：为了开发一个流行病学和临床适用的平台，用于从深肺中独特捕获的大分子，研究团队将寻求一种新方法，包括咳嗽收集，并测试分离咳嗽标本对深肺的有效性和实用性特定的细胞外囊泡 (EV)。 该咳嗽标本将与侵入性采集的肺部深部样本 BAL/支气管刷洗标本进行比较，并与来自同一个人的潜在污染性漱口水进行比较。 研究小组最初建议检查这些原始咳嗽标本，然后检查 EV 分区气道样本，通过 SMM 批量测序检查体细胞突变、Vijg/Maslov 实验室开发的最先进技术以及已知特异性的蛋白质对于肺，而不是口腔/唾液，在 Sidoli/蛋白质组学核心中。

具体目标：

1. 将通过空气室或等效/优化设备在 5 名健康志愿者和 5 名当前吸烟者中捕获咳嗽，同时使用漱口水和 BAL。 通过深肺捕获（Loudig 实验室）从这些相同样本中提取的肺特异性 EV 将同时进行。
2. 咳嗽将使用单分子突变测序 (SMM-seq) 进行 DNA 突变分析。
3. 咳嗽药、漱口水和 BAL 将在我们的核心设施中使用 LC-MS 进行蛋白质组学分析。

方法：

一般而言，人类肺部研究方案实践：正在进行的受试者注册是长期 IRB 批准的 Einstein-Montefiore 临床病例控制方案 (2007-407) 的一部分。 有资格参加的肺科医师为：年龄 > 21 岁，任何吸烟状况，除 BAL 禁忌症外的多种合并症，计划将临床指示的肺部采集程序（支气管镜检查）作为常规护理的一部分。 这相当于每年招募超过 100-150 名支气管镜检查和相关的前吸烟者捐赠者。 超过 150-200 个这样的预先存在的支气管镜样本集和伴随的非侵入性 EBC，连同 MW、口腔刷等] 被储存起来并可能用于当前的研究。 所有数据/标本均在诊断前和手术前收集；每个受试者在支气管镜检查前提供 EBC（和其他非侵入性检查，例如咳嗽）样本。 因此，该主动协议最大限度地减少了 (i) 回忆偏差； (ii) 非侵入性标本因这些肺部手术固有的肺组织破坏和溢出而受到污染。 每个受试者将在医疗记录中被跟踪 3 个月，以收集更新的诊断/测试，并最大限度地减少病例对照错误分类。 可获得广泛的人口统计、暴露和临床数据：(1) 人口统计信息； (2) 吸烟细节： (3) 潜在肺部疾病的标志物： (4) 现有影像学 (5) 临床信息/病理学发现。 对于这个 ICTR 试点项目：

1. 目标 1：在进行支气管镜检查之前，将捕获 5 名健康志愿者和 5 名当前吸烟者的咳嗽。 还将收集研究 BAL 和漱口水样本。 通过深肺捕获（Loudig 实验室）从这些样本中提取的肺特异性 EV 将同时进行。

咳嗽将在气室（用于哮喘计量吸入器/泵的普通一次性手持间隔装置）中被捕获。 研究小组发现它是一个足够的咳嗽（用力呼气）捕获设备，有待进一步优化。 根据一项计划中的修正案，患者被要求每 30 秒向手持式塑料腔咳嗽一次，持续 10 分钟。 然后用 2-4 ml PBS 冲洗整个腔室的所有内表面，并将冲洗/清洗液快速冷冻。 随后根据要研究的分析物处理冲洗液。 对于 DNA，有一个异丙醇/EtOH 沉淀步骤，然后以较小的体积重新悬浮，然后通过 Qiagen/Zymo DNA 分离试剂盒提取。 对于蛋白质，PBS 中的粗提物通过沉淀、干燥、在缓冲液中重悬并注入 LC-MS 平台进行鸟枪法分析，直接在岩芯中进行处理。

EV 分区程序已发布。 EV-CATCHER™ 可以定制，以针对特定于所需细胞类型的独特表面膜蛋白，从而直接捕获细胞特异性 EV。 Loudig 实验室收集了大量数据，例如，使用针对深部肺细胞独特和特异性蛋白质（例如 Clara 细胞特异性蛋白质 (CCSP)、肺泡 2 型细胞表面活性蛋白-C (SFTPC)）的抗体可以特异性纯化 EV来自支气管肺泡灌洗液 (BAL) 和呼出气冷凝液 (EBC)，并获得相似的 miRNA 表达谱。 最后，通过在固定平台（聚苯乙烯 96 孔板）和活化抗体之间添加可酶促降解的尿酰化双链生物素标记 DNA 接头，可以促进通过尿嘧啶糖基化酶 (UNG) 孵育免疫纯化的 EV 的完整释放。

方法：从提供咳嗽、漱口水和 BAL 样本的 10 名初始捐赠者（5 名当前吸烟者，5 名从不吸烟者）中提取的等分试样在用于 EV 划分的所有样本类型中总共 30 个初始样本。 然后，将生成完整的未分区样本和 EV 分区样本（共 60 个样本），以分流到两个主要检测方法，体细胞突变的 SMM 和下面的鸟枪蛋白质组学，用于可行性论证和代孕试验评估咳嗽肺。

目标 2：Cough 将使用 SMM 进行 DNA 突变分析。 直接分析正常细胞中的基因组序列完整性。 研究正常人体组织中基因组序列完整性的一个关键问题是基因组中 DNA 突变的随机性。 虽然一些突变是克隆扩增的，但绝大多数突变对于每个细胞都是独一无二的，因此是罕见的和变异的，这需要单细胞全基因组扩增或体外克隆扩增测定。 这两种方法都与工件相关联。 最近，Maslov/Vijg 实验室开发了可靠的方法来定量评估单细胞或克隆扩增的单细胞中的体细胞突变。 使用这些方法证明了近端支气管上皮基底细胞中的碱基替代突变随着吸烟（和年龄）的增加而增加。 一种更新的体细胞突变定量分析方法，单分子突变序列 (SMM-seq)，更具成本效益，可应用于少量大量 DNA。 这种最新的 SMM-seq 方法意义重大，因为除其他考虑因素外，它还提供了一种准确检测细胞学正常细胞突变的实用方法。

方法：20 个咳嗽样本（10 个未分级，10 个分级）将按照方案中的描述进行 DNA 提取、文库制备和测序。 所有检测到的变体之间的体细胞突变是通过减去通过分析同一个体的 DNA 的常规测序文库发现的种系多态性而发生的。 体细胞变异的数量被归一化为可调用碱基的数量，即 SMM-seq 库中覆盖率超过 7 倍，常规库中覆盖率超过 20 倍的碱基。 体细胞突变频率将表示为每个基因组的突变数量。 鉴于预算限制，其余 40 个样本（20 个来自漱口水，20 个来自 BAL）将在其他正在进行的资助机制下进行处理。

目标 3：咳嗽、漱口水和 BAL 将在 Einstein 的核心设施中使用 LC-MS 进行蛋白质组学分析。 据研究团队所知，先前对咳嗽的蛋白质组学尝试并不存在，这可能是由于低丰度材料的技术限制。 蛋白质组学核心（Sidoli 等人）将优化策略以提高量化低丰度蛋白质/肽的灵敏度和速度。 样品制备方案将进行修改，以最大限度地减少样品损失，并将纳米液相色谱与最先进的 MS 相结合，以量化 BAL、MW 和 EBC 样品中的蛋白质/肽。

方法：蛋白质组学样品制备：将咳嗽标本干燥至完成，然后重悬于 5 µL 50 mM 碳酸氢铵 (pH = 8) 中，用于典型蛋白质组学样品制备（20 ng 胰蛋白酶）。 然后使用 Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) 纳米液相色谱仪与 Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) 质谱仪在线分析整个样品。 对于分离，实验室将使用内部填充分析柱，内径最小（50 µm ID，25 cm 长），以便分离流速约为 100 nL/min 的分子。 低流速增强了从色谱柱洗脱的样品的预浓缩，从而导致亚阿摩尔灵敏度。

然后使用 Sidoli 实验室中的管道执行数据分析，包括数据转换。 简而言之，使用 Proteome Discoverer（v2.5，Thermo Scientific）识别和量化蛋白质组学 MS 光谱，其阈值比社区目前推荐的错误发现率（光谱匹配、肽和蛋白质 <1% FDR）更严格。 然后按照 Sidoli 实验室的描述对定量值进行转换和标准化。 使用参数统计评估统计调节 (p< 0.05)。 鉴于候选名单相对较短，色谱图是手动检查的。

所有咳嗽样本（10 个未分级、10 个分级 x 3 种样本类型 = 60 个样本）将按照所述进行蛋白质组学分析。

跨室比较：确定肺部咳嗽替代物的方法与确定肺部 EBC 替代物的方法类似。 在给定平台内，将比较 SMM 突变的级别（和特征）。 最近在呼出的 microRNA 环境中（此处未提出），这是通过主要成分中 microRNA-seq 数据聚类的 Spearman 相关性、PCA（未显示）和 Spearman 相关性（未显示）执行的。 对于蛋白质组学环境，可以通过聚类热图、PCA 和 Spearman 相关性等方法类似地显示咳嗽对肺的这种替代作用。

结果：咳嗽作为新平台生物样本的初步试点测试是高风险、高回报的实用转化工作。 如果这个试点项目表明咳嗽是肺部的有效替代品，那么在所检查的两个平台上，这将为支持进一步的联邦资助提供强有力的初步证据。 这种基于气道的肺部入口的潜力可以设想用于各种急性和慢性临床和公共卫生目的。