Hostefangst som en portal ind i lungen (CC1)

Hypotese: Hoste kan tjene som et gyldigt ikke-invasivt surrogat for lungen for store molekyler såsom DNA og proteiner, potentielt til en række forskellige kliniske og folkesundhedsmæssige formål.

Forslag i korte træk: Til udvikling af en epidemiologisk og klinisk anvendelig platform for store molekyler fanget unikt fra dybe lunger, vil efterforskerteamet forfølge en ny tilgang, der inkluderer hosteopsamling og test af effektiviteten og praktisk anvendelighed af opdeling af hosteprøver til dyb lunge specifikke ekstracellulære vesikler (EV'er). Denne hosteprøve vil blive sammenlignet med den fra invasivt indsamlede dybe lungeprøver BAL/bronkialbørstning og med potentielt kontaminerende mundskyllevand, alle fra de samme individer. Undersøgelsesholdet foreslår i første omgang at undersøge disse rå hosteprøver og derefter EV-partitionerede luftvejsprøver for somatiske mutationer ved SMM-bulksekvensering for somatiske mutationer, avancerede teknikker udviklet i Vijg/Maslov-laboratorierne og for proteiner, der vides at være specifikke for lunge, i modsætning til mundhule/spyt, i Sidoli/proteomics-kernen.

Specifikke mål:

1. Hoste vil blive fanget af flyvekammer eller tilsvarende/optimeret apparat hos 5 raske frivillige, og hos 5 nuværende rygere, parallelt med mundskyllevand og med BAL. Lungespecifikke EV'er fra de samme prøver via dyb lungeindfangning (Loudig lab) vil blive udført parallelt.
2. Hoste vil gennemgå DNA-mutationsanalyser ved hjælp af enkeltmolekyle mutationssekventering (SMM-seq).
3. Hoste, mundskyl og BAL vil gennemgå proteomisk analyse ved hjælp af LC-MS i vores Core-facilitet.

Nærme sig:

Human Lung Studies protokol praksis generelt: Løbende emnetilmelding er en del af en mangeårig IRB-godkendt Einstein-Montefiore klinisk case-control protokol (2007-407). Personer fra lungepraksis, der er berettiget til at tilmelde sig, er: Alder > 21 år, enhver rygestatus, utallige komorbide status undtagen kontraindikationer til BAL, planlagt til klinisk indiceret lungeindsamlingsprocedure (bronkoskopi) som en del af rutinepleje. Dette svarer til >100-150 rekrutter til bronkoskopi og relaterede tidligere rygerdonorer om året. Over 150-200 sådanne allerede eksisterende bronkoskopiske prøvesæt og medfølgende ikke-invasiv EBC, sammen med MW, buccal brush, andre] er samlet og potentielt tilgængelige for den aktuelle undersøgelse. Alle data/prøver er indsamlet før diagnose og præ-procedure; hvert forsøgsperson giver EBC-prøver (og andre ikke-invasive som f.eks. hoste) prøver før bronkoskopi. Som sådan minimerer denne aktive protokol (i) recall bias; og (ii) kontaminering af ikke-invasive prøver fra forstyrrelser og udslip af lungevæv, der er forbundet med disse lungeprocedurer. Hvert individ vil blive fulgt i 3 måneder i journalen for at indsamle opdateret diagnostik/testning og minimere fejlklassificering af tilfælde-kontrol. Omfattende demografiske, eksponerings- og kliniske data er tilgængelige: (1) demografiske oplysninger; (2) rygedetaljer: (3) markører for underliggende lungesygdom: (4) eksisterende billeddannelse (5) klinisk information/patologiske fund. Til denne ICTR-pilot:

1. Mål 1: Hoste vil blive fanget hos 5 raske frivillige og hos 5 nuværende rygere, inden de gennemgår bronkoskopi. Forsknings-BAL- og mundskylleprøver vil også blive indsamlet. Lungespecifikke EV'er fra disse prøver via dyb lungeindfangning (Loudig lab) vil blive udført parallelt.

Hoste vil blive fanget i aerochamber (almindelig, engangshåndholdt afstandsanordning til astmamåler dosisinhalatorer/pumper). Efterforskerholdet har fundet ud af, at det er en passende hoste (tvungen udånding) opfangningsanordning, i afventning af yderligere optimering. I henhold til en planlagt ændring instrueres patienten i at hoste hvert 30. sekund ind i det håndholdte plastkammer i en samlet periode på 10 minutter. Alle indvendige overflader af hele kammeret skylles derefter med 2-4 ml PBS, og skylningen/vasken lynfryses. Skylningen behandles efterfølgende i henhold til den analyt, der skal undersøges. For DNA er der et isopropanol/EtOH-fældningstrin efterfulgt af resuspension i mindre volumen og ekstraktion med Qiagen/Zymo DNA-isoleringskit. For protein håndteres råekstraktet i PBS direkte i kernen ved udfældning, tørring, resuspension i buffer og injektion i LC-MS-platformen til haglgeværanalyser.

EV-partitioneringsproceduren er offentliggjort. EV-CATCHER™ kan tilpasses til at målrette unikke overflademembranproteiner, der er specifikke for den ønskede celletype og dermed direkte indfangning af cellespecifikke EV'er. Loudig-laboratoriet har samlet omfattende data, der for eksempel viser, at brug af antistoffer rettet mod dybe lungecellers unikke og specifikke proteiner (f.eks. Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) kan specifikt oprense EV'er fra bronkoalveolære udskylninger (BAL) og udåndede åndedrætskondensater (EBC) og opnå lignende miRNA-ekspressionsprofiler. Endelig, ved at tilføje en enzymatisk nedbrydelig uracyleret dobbeltstrenget biotin-mærket DNA-linker mellem immobiliserende platform (polystyren 96-brønds plade) og det aktiverede antistof, kan den intakte frigivelse af immunoprensede EV'er ved inkubation med uracilglycosylase (UNG) lettes.

Fremgangsmåde: Alikvoter fra de 10 indledende donorer, der giver hoste-, mundskylle- og BAL-prøver (5 nuværende rygere, 5 aldrig-rygere) på i alt 30 indledende prøver blandt alle prøvetyper til EV-opdeling. Derefter vil både hel-uopdelte og EV-opdelte prøver blive genereret (i alt 60 prøver), der skal triageres til de to hovedassays, SMM for somatisk mutation, og haglgeværproteomik, nedenfor, både til demonstration af gennemførlighed og pilotevaluering af surrogatmoderskab. hoste for lunge.

Mål 2: Hoste vil gennemgå DNA-mutationsanalyser ved hjælp af SMM. Direkte analyse af genomsekvensintegritet i normale celler. Et nøgleproblem ved undersøgelse af genomsekvensintegritet i normale menneskelige væv er den tilfældige natur af DNA-mutationer i genomet. Mens nogle mutationer er klonalt amplificeret, er langt de fleste unikke for hver celle og derfor sjældne og varianter, hvilket nødvendiggør enten enkeltcellet helgenomamplifikation eller in vitro klonale amplifikationsassays. Begge tilgange er blevet forbundet med artefakter. For nylig udviklede Maslov/Vijg-laboratoriet pålidelige metoder til kvantitativ vurdering af somatiske mutationer i enkeltceller eller i klonalt amplificerede enkeltceller. Ved anvendelse af disse metoder blev det påvist, at basesubstitutionsmutationer øges med rygning (og alder) i proksimale bronkiale epitelbasalceller. En nyere metode til kvantitativ analyse af somatiske mutationer, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), er meget mere omkostningseffektiv og kan anvendes på små mængder bulk-DNA. Denne seneste SMM-seq-metode er vigtig, fordi den blandt andet tillader et praktisk middel til nøjagtigt at detektere mutationer i cytologisk normale celler.

Fremgangsmåde: De 20 hosteprøver (10 ufraktionerede, 10 fraktionerede) vil gennemgå DNA-ekstraktion og biblioteksforberedelse og sekventering som beskrevet i protokollen. Somatiske mutationer blandt alle de påviste varianter forekommer ved subtraktion af kimlinjepolymorfismer fundet ved analyse af regulært sekventeringsbibliotek fra DNA fra det samme individ. Antallet af somatiske varianter er normaliseret til antallet af kaldbare baser, dvs. baser med dækning mere end 7X i SMM-seq biblioteker og med dækning mere end 20X i almindelige biblioteker. Somatisk mutationsfrekvens vil blive udtrykt som et antal mutationer pr. genom. De resterende 40 prøver (20 fra mundskyl og 20 fra BAL) vil blive behandlet under andre igangværende finansieringsmekanismer, givet budgetmæssige begrænsninger.

Mål 3: Hoste, mundskyl og BAL vil gennemgå proteomisk analyse ved hjælp af LC-MS i Einsteins Core-facilitet. Tidligere proteomiske forsøg ved hoste eksisterer ikke efter undersøgelsesteamets viden, måske på grund af tekniske begrænsninger af materiale med lav mængde. Proteomics-kernen (Sidoli, et al) vil optimere en strategi for at øge følsomheden og hastigheden til kvantificering af proteiner/peptider med lav overflod. Prøveforberedelsesprotokollen vil blive modificeret for at minimere prøvetab og miniaturisere nano-væskekromatografi koblet med state-of-the-art MS for at kvantificere proteiner/peptider i BAL-, MW- og EBC-prøver.

Fremgangsmåde: Prøveforberedelse til proteomik: Hosteprøven tørres til færdiggørelse og resuspenderes derefter i 5 µL 50 mM ammoniumbicarbonat (pH = 8) til kanonisk proteomikprøveforberedelse (20 ng trypsin). Hele prøven analyseres derefter ved hjælp af en Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nano-væskekromatograf koblet online med et Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) massespektrometer. Til adskillelse vil laboratoriet bruge en intern pakket analytisk kolonne med minimal indre diameter (50 µm ID, 25 cm længde), så molekyler med en ~100 nL/min flowhastighed kan adskilles. Den lave strømningshastighed giver øget prækoncentration af prøven, der eluerer fra søjlen, hvilket fører til sub-atomolfølsomhed.

Dataanalyse, herunder datatransformation, udføres derefter ved hjælp af en pipeline i Sidoli-laboratoriet. Kort fortalt identificeres og kvantificeres proteomics MS-spektre ved hjælp af Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) med tærskler, der er strengere end i øjeblikket anbefalet af fællesskabet for falsk opdagelsesrate (<1 % FDR for spektrummatches, peptider og proteiner). Kvantitative værdier transformeres derefter og normaliseres som beskrevet af Sidoli-laboratoriet. Statistisk regulering vurderes ved hjælp af parametrisk statistik (p< 0,05). Kromatogrammer inspiceres manuelt, givet den relativt korte liste af kandidater.

Alle hosteprøver (10 ufraktionerede, 10 fraktionerede x 3 prøvetyper=60 prøver) vil gennemgå proteomisk analyse som beskrevet.

Sammenligninger på tværs af rum: Bestemmelse af hoste-surrogacy for lunge kan udføres på samme måde som den, der udføres for EBC-surrogacy for lungen. Inden for en given platform vil niveauerne (og signaturen) af SMM-mutation blive sammenlignet. I den seneste tid i det udåndede mikroRNA-miljø (ikke foreslået her) er dette blevet udført ved Spearman-korrelationer af mikroRNA-seq-dataklyngning i hovedkomponenter, PCA (ikke vist) og Spearman-korrelationer (ikke vist). For proteomics-miljøet kan dette surrogati af hoste til lunge vises for hoste på samme måde ved at gruppere heatmaps, PCA og metoder som Spearman-korrelation.

Resultat: Denne indledende pilottest af hoste som en ny platformsbioprøve er pragmatisk translationelt arbejde med høj risiko og høj belønning. Hvis dette pilotprojekt viser, at hoste er et gyldigt surrogat for lunge, på de to undersøgte platforme, så vil det give stærke foreløbige beviser for at støtte yderligere føderal finansiering. Dette potentiale for en luftvejsbaseret portal til lungen kunne forestilles til en bred vifte af akutte og kroniske kliniske og offentlige sundhedsformål.