Captura da tosse como um portal para o pulmão (CC1)

Hipótese: A tosse pode servir como um substituto não invasivo válido para o pulmão para grandes moléculas, como DNA e proteínas, potencialmente para uma variedade de propósitos clínicos e de saúde pública.

Proposta resumida: Para o desenvolvimento de uma plataforma epidemiológica e clinicamente aplicável para grandes moléculas capturadas exclusivamente do pulmão profundo, a equipe de investigadores buscará uma nova abordagem que inclua coleta de tosse e teste da eficácia e praticidade de particionamento de amostra de tosse para pulmão profundo vesículas extracelulares (EVs) específicas. Este espécime de tosse será comparado com o de amostras pulmonares profundas coletadas de forma invasiva em escovações BAL/brônquicas e com o enxaguatório bucal potencialmente contaminante, todos dos mesmos indivíduos. A equipe de estudo propõe inicialmente examinar essas amostras brutas de tosse e, em seguida, amostras de vias aéreas particionadas por EV, para mutações somáticas por sequenciamento em massa SMM para mutações somáticas, técnicas de ponta desenvolvidas nos laboratórios Vijg/Maslov e para proteínas conhecidas por serem específicas para pulmão, em oposição a cavidade oral/saliva, no núcleo Sidoli/proteômica.

Objetivos Específicos:

1. A tosse será captada por aerochamber ou dispositivo equivalente/otimizado em 5 voluntários saudáveis ​​e em 5 fumantes atuais, em paralelo com bochechos e com BAL. EVs específicos do pulmão dessas mesmas amostras por meio de captura pulmonar profunda (laboratório Loudig) serão realizados em paralelo.
2. A tosse passará por análises de mutação de DNA usando sequenciamento de mutação de molécula única (SMM-seq).
3. Tosse, bochechos e BAL serão submetidos à análise proteômica usando LC-MS em nossa instalação principal.

Abordagem:

Práticas de protocolo de Estudos de Pulmão Humano, em geral: A inscrição em andamento de indivíduos faz parte de um protocolo de controle de caso clínico Einstein-Montefiore aprovado pelo IRB (2007-407). Indivíduos de práticas pulmonares elegíveis para inscrição são: Idade > 21 anos, qualquer status de fumante, uma miríade de comorbidades, exceto contra-indicações para BAL, planejado para procedimento de coleta pulmonar clinicamente indicado (broncoscopia) como parte dos cuidados de rotina. Isso equivale a mais de 100-150 broncoscopias e recrutas de doadores de ex-fumantes relacionados por ano. Mais de 150-200 desses conjuntos de amostras broncoscópicas pré-existentes e EBC não invasivo de atendimento, juntamente com MW, escova bucal, outros] são armazenados e potencialmente disponíveis para o estudo atual. Todos os dados/espécimes são coletados pré-diagnóstico e pré-procedimento; cada indivíduo fornece amostras de EBC (e outros não invasivos, como tosse) antes da broncoscopia. Como tal, este protocolo ativo minimiza (i) viés de memória; e (ii) contaminação de espécimes não invasivos pelas rupturas e derramamento do tecido pulmonar inerente a esses procedimentos pulmonares. Cada sujeito será acompanhado por 3 meses no prontuário médico para coletar diagnósticos/testes atualizados e minimizar erros de classificação de caso-controle. Extensos dados demográficos, de exposição e clínicos estão disponíveis: (1) informações demográficas; (2) detalhes do tabagismo: (3) marcadores de doença pulmonar subjacente: (4) exames de imagem existentes (5) informações clínicas/achados patológicos. Para este piloto ICTR:

1. Objetivo 1: A tosse será capturada em 5 voluntários saudáveis ​​e em 5 fumantes atuais antes da broncoscopia. Também serão coletadas amostras de BAL para pesquisa e enxaguatórios bucais. EVs específicos do pulmão dessas amostras por meio de captura pulmonar profunda (laboratório Loudig) serão realizados em paralelo.

A tosse será capturada na câmara de ar (dispositivo espaçador portátil descartável comum para inaladores/bombas de dose para asma). A equipe de investigadores descobriu que é um dispositivo de captura de tosse (exalação forçada) adequado, aguardando otimização adicional. Sob uma alteração planejada, o paciente é instruído a tossir a cada 30 segundos na câmara de plástico portátil, durante um período total de 10 minutos. Todas as superfícies internas de toda a câmara são então enxaguadas com 2-4 ml de PBS, e o enxágue/lavagem é congelado rapidamente. O enxágue é posteriormente processado de acordo com o analito a ser estudado. Para o DNA, há uma etapa de precipitação com Isopropanol/EtOH, seguida de ressuspensão em menor volume e extração pelo kit de isolamento de DNA Qiagen/Zymo. Para proteína, o extrato bruto em PBS é tratado diretamente no núcleo por precipitação, secagem, ressuspensão em tampão e injeção na plataforma LC-MS para análises shotgun.

O procedimento de particionamento EV é publicado. O EV-CATCHER™ pode ser personalizado para direcionar proteínas de membrana de superfície únicas específicas para o tipo de célula desejado e, assim, para direcionar a captura de EVs específicos da célula. O laboratório Loudig compilou dados extensos demonstrando, por exemplo, que o uso de anticorpos direcionados a proteínas únicas e específicas de células pulmonares profundas (por exemplo, proteína específica da célula Clara (CCSP), proteína alveolar tipo 2 do surfactante C (SFTPC)) pode purificar especificamente EVs de lavagens broncoalveolares (BAL) e condensados ​​de respiração exalada (EBC) e obter perfis de expressão de miRNA semelhantes. Finalmente, adicionando um ligante de DNA de fita dupla uracilado enzimaticamente degradável marcado com biotina entre a plataforma imobilizadora (placa de 96 poços de poliestireno) e o anticorpo ativado, a liberação intacta de EVs imunopurificados por incubação com uracil glicosilase (UNG) pode ser facilitada.

Abordagem: Alíquotas dos 10 doadores iniciais fornecendo amostras de tosse, bochechos e BAL (5 fumantes atuais, 5 nunca fumantes), totalizando 30 amostras iniciais entre todos os tipos de amostras para partição de EV. Em seguida, serão geradas amostras totalmente não particionadas e particionadas por EV (totalizando 60 amostras) para serem triadas para os dois ensaios principais, SMM para mutação somática e proteômica shotgun, abaixo, ambos para demonstração de viabilidade e avaliação piloto de substituição de tosse para pulmão.

Objetivo 2: A tosse passará por análises de mutação de DNA usando SMM. Análise direta da integridade da sequência do genoma em células normais. Um problema chave no estudo da integridade da sequência do genoma em tecidos humanos normais é a natureza aleatória das mutações do DNA no genoma. Embora algumas mutações sejam amplificadas por clonagem, a grande maioria é única para cada célula e, portanto, rara e variante, o que requer amplificação do genoma inteiro de célula única ou ensaios de amplificação clonal in vitro. Ambas as abordagens têm sido associadas a artefatos. Recentemente, o laboratório Maslov/Vijg desenvolveu métodos confiáveis ​​para avaliar quantitativamente mutações somáticas em células individuais ou em células individuais amplificadas por clonagem. Usando esses métodos, foi demonstrado que as mutações de substituição de base aumentam com o tabagismo (e idade) nas células basais do epitélio brônquico proximal. Um método mais recente para a análise quantitativa de mutações somáticas, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), é muito mais econômico e pode ser aplicado a pequenas quantidades de DNA em massa. Este último método SMM-seq é significativo porque permite, entre outras considerações, um meio prático para detectar com precisão mutações em células citologicamente normais.

Abordagem: As 20 amostras de tosse (10 não fracionadas, 10 fracionadas) serão submetidas à extração de DNA, preparação da biblioteca e sequenciamento conforme descrito no protocolo. As mutações somáticas entre todas as variantes detectadas ocorrem pela subtração dos polimorfismos germinativos encontrados pela análise da biblioteca de sequenciamento regular do DNA do mesmo indivíduo. O número de variantes somáticas é normalizado para o número de bases chamáveis, ou seja, bases com cobertura superior a 7X nas bibliotecas SMM-seq e com cobertura superior a 20X nas bibliotecas regulares. A frequência de mutação somática será expressa como um número de mutações por genoma. As restantes 40 amostras (20 de bochechos e 20 de BAL) serão processadas ao abrigo de outros mecanismos de financiamento em curso, dadas as restrições orçamentais.

Objetivo 3: Tosse, bochechos e BAL serão submetidos à análise proteômica usando LC-MS nas instalações do núcleo do Einstein. Tentativas anteriores de proteômica na tosse não existem para o conhecimento da equipe de investigadores, talvez devido a limitações técnicas de material de baixa abundância. O núcleo de proteômica (Sidoli, et al) otimizará uma estratégia para aumentar a sensibilidade e a velocidade para quantificar proteínas/peptídeos de baixa abundância. O protocolo de preparação da amostra será modificado para minimizar a perda de amostra e miniaturizar a cromatografia nanolíquida acoplada ao MS de última geração para quantificar proteínas/peptídeos em amostras BAL, MW e EBC.

Abordagem: Preparação da amostra para proteômica: A amostra de tosse é totalmente seca e ressuspensa em 5 µL de bicarbonato de amônio 50 mM (pH = 8) para preparação de amostra de proteômica canônica (20 ng de tripsina). A amostra inteira é então analisada usando um cromatógrafo nanolíquido Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) acoplado on-line com um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Para a separação, o laboratório utilizará uma coluna analítica empacotada interna com diâmetro interno mínimo (50 µm ID, 25 cm de comprimento) para que as moléculas com uma taxa de fluxo de ~100 nL/min possam ser separadas. A baixa taxa de fluxo fornece pré-concentração aprimorada da amostra eluída da coluna, levando a sensibilidade subattomole.

A análise de dados, incluindo a transformação de dados, é realizada usando um pipeline no laboratório Sidoli. Resumidamente, os espectros proteômicos de MS são identificados e quantificados usando o Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) com limites mais rigorosos do que atualmente recomendados pela comunidade para taxa de descoberta falsa (<1% FDR para correspondências de espectro, peptídeos e proteínas). Os valores quantitativos são então transformados e normalizados conforme descrito pelo laboratório Sidoli. A regulação estatística é avaliada por meio de estatísticas paramétricas (p< 0,05). Os cromatogramas são inspecionados manualmente, dada a lista relativamente curta de candidatos.

Todas as amostras de tosse (10 não fracionadas, 10 fracionadas x 3 tipos de amostra = 60 amostras) serão submetidas à análise proteômica conforme descrito.

Comparações entre compartimentos: A determinação da substituição da tosse para o pulmão pode ser realizada de maneira análoga àquela realizada para a substituição do EBC para o pulmão. Dentro de uma determinada plataforma, os níveis (e assinatura) da mutação SMM serão comparados. No passado recente, no ambiente de microRNA exalado (não proposto aqui), isso foi realizado por correlações de Spearman de agrupamento de dados microRNA-seq em componentes principais, PCA (não mostrado) e correlações de Spearman (não mostrado). Para o ambiente de proteômica, essa substituição de tosse por pulmão pode ser mostrada para tosse de forma semelhante por agrupamento de mapas de calor, PCA e métodos como a correlação de Spearman.

Resultado: Este teste piloto inicial de tosse como um novo bioespécime de plataforma é um trabalho de tradução pragmática de alto risco e alta recompensa. Se este projeto piloto mostrar que a tosse é um substituto válido para o pulmão, nas duas plataformas examinadas, isso fornecerá fortes evidências preliminares para apoiar mais financiamento federal. Este potencial para um portal baseado nas vias aéreas para o pulmão pode ser imaginado para uma ampla variedade de propósitos clínicos e de saúde pública agudos e crônicos.