Przechwycenie kaszlu jako portal do płuc (CC1)

Hipoteza: Kaszel może służyć jako ważny nieinwazyjny substytut płuc dla dużych cząsteczek, takich jak DNA i białka, potencjalnie do różnych celów klinicznych i zdrowia publicznego.

Propozycja w skrócie: W celu opracowania epidemiologicznej i nadającej się do zastosowania klinicznego platformy dla dużych cząsteczek wychwyconych w unikalny sposób z głębokich płuc, zespół badaczy zastosuje nowe podejście, które obejmuje zbieranie kaszlu oraz testowanie skuteczności i praktyczności podziału próbki kaszlu na głębokie płuca specyficzne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV). Ta próbka kaszlu zostanie porównana z próbkami pobranymi inwazyjnie z głębokich płuc BAL/szczotkowaniem oskrzeli oraz z potencjalnie zanieczyszczającą próbką płynu do płukania jamy ustnej, wszystkie od tych samych osób. Zespół badawczy początkowo proponuje zbadanie tych surowych próbek kaszlu, a następnie próbek dróg oddechowych podzielonych na EV, pod kątem mutacji somatycznych za pomocą masowego sekwencjonowania SMM pod kątem mutacji somatycznych, najnowocześniejszych technik opracowanych w laboratoriach Vijg/Maslov oraz białek, o których wiadomo, że są swoiste dla płuc, w przeciwieństwie do jamy ustnej/śliny, w rdzeniu Sidoli/proteomika.

Cele szczegółowe:

1. Kaszel zostanie wyłapany za pomocą komory powietrznej lub równoważnego/zoptymalizowanego urządzenia u 5 zdrowych ochotników i u 5 obecnych palaczy, równolegle z płukaniem ust i BAL. Specyficzne dla płuc EV z tych samych próbek poprzez wychwytywanie z głębokiego płuca (laboratorium Loudig) będą wykonywane równolegle.
2. Kaszel zostanie poddany analizom mutacji DNA przy użyciu sekwencjonowania mutacji pojedynczej cząsteczki (SMM-seq).
3. Kaszel, płyn do płukania jamy ustnej i BAL zostaną poddane analizie proteomicznej przy użyciu LC-MS w naszej centralnej placówce.

Zbliżać się:

Ogólna praktyka dotycząca protokołu Human Lung Studies: Bieżąca rekrutacja uczestników jest częścią zatwierdzonego przez IRB od dawna protokołu klinicznej kontroli przypadku Einsteina-Montefiore'a (2007-407). Osoby z poradni pulmonologicznych kwalifikujące się do rejestracji to: Wiek > 21 lat, palenie tytoniu, niezliczone choroby współistniejące z wyjątkiem przeciwwskazań do BAL, planowane do klinicznie wskazanego zabiegu pobrania płuc (bronchoskopia) w ramach rutynowej opieki. Odpowiada to > 100-150 bronchoskopii i pokrewnym rekrutom dawców byłych palaczy rocznie. Ponad 150-200 takich istniejących wcześniej zestawów próbek bronchoskopowych i towarzyszących nieinwazyjnych EBC, wraz z MW, szczoteczką policzkową i innymi] jest zgromadzonych i potencjalnie dostępnych do bieżącego badania. Wszystkie dane/próbki są zbierane przed diagnozą i przed zabiegiem; każdy pacjent dostarcza próbki EBC (i innych nieinwazyjnych, takich jak kaszel) przed bronchoskopią. Jako taki, ten aktywny protokół minimalizuje (i) błąd przypominania; oraz (ii) zanieczyszczenie próbek nieinwazyjnych w wyniku przerwania i rozlania tkanki płucnej nieodłącznie związanej z tymi procedurami dotyczącymi płuc. Każdy pacjent będzie obserwowany przez 3 miesiące w dokumentacji medycznej, aby zebrać zaktualizowaną diagnostykę/testy i zminimalizować błędną klasyfikację kontroli przypadków. Dostępne są obszerne dane demograficzne, ekspozycja i dane kliniczne: (1) informacje demograficzne; (2) szczegóły dotyczące palenia: (3) markery podstawowej choroby płuc: (4) istniejące obrazowanie (5) informacje kliniczne/wyniki patologiczne. W przypadku tego pilotażowego ICTR:

1. Cel 1: Złapanie kaszlu u 5 zdrowych ochotników oraz u 5 osób palących przed wykonaniem bronchoskopii. Zostaną również pobrane próbki BAL i płynu do płukania jamy ustnej. Specyficzne dla płuc EV z tych próbek poprzez głębokie wychwytywanie płuc (laboratorium Loudig) będą wykonywane równolegle.

Kaszel będzie wychwytywany w komorze powietrznej (powszechne, jednorazowe urządzenie dystansowe do inhalatorów/pompek z miernikiem astmy). Zespół badaczy stwierdził, że jest to odpowiednie urządzenie do wychwytywania kaszlu (wymuszonego wydechu) w oczekiwaniu na dalszą optymalizację. Zgodnie z planowaną poprawką, pacjentowi zaleca się kaszel co 30 sekund do podręcznej plastikowej komory przez całkowity okres 10 minut. Następnie wszystkie wewnętrzne powierzchnie całej komory przemywa się 2-4 ml PBS, a popłuczyny/płuczki szybko zamraża się. Płukanie jest następnie przetwarzane zgodnie z badanym analitem. W przypadku DNA istnieje etap wytrącania izopropanolem/EtOH, po którym następuje ponowne zawieszenie w mniejszej objętości i ekstrakcja za pomocą zestawu do izolacji DNA Qiagen/Zymo. W przypadku białka surowy ekstrakt w PBS jest przetwarzany bezpośrednio w rdzeniu przez wytrącanie, suszenie, ponowne zawieszenie w buforze i wstrzyknięcie do platformy LC-MS do analiz typu shotgun.

Opublikowano procedurę partycjonowania EV. EV-CATCHER™ można dostosować tak, aby celował w unikalne białka błony powierzchniowej, specyficzne dla pożądanego typu komórek, a tym samym bezpośrednio wychwytywał specyficzne dla komórki EV. Laboratorium Loudig zebrało obszerne dane wykazujące na przykład, że użycie przeciwciał ukierunkowanych na unikalne i specyficzne białka komórek głębokich płuc (np. Clara Cell Specific Protein (CCSP), alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) może specyficznie oczyszczać EV z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) i kondensatów wydychanego powietrza (EBC) i uzyskać podobne profile ekspresji miRNA. Wreszcie, dodając enzymatycznie degradowalny uracylowany dwuniciowy łącznik DNA znakowany biotyną między platformą unieruchamiającą (96-dołkową płytkę polistyrenową) a aktywowanym przeciwciałem, można ułatwić nienaruszone uwalnianie immunooczyszczonych EV przez inkubację z glikozylazą uracylu (UNG).

Podejście: Podwielokrotności od 10 początkowych dawców dostarczających próbki kaszlu, płynu do płukania ust i BAL (5 obecnych palaczy, 5 nigdy nie palących), w sumie 30 początkowych próbek spośród wszystkich typów próbek do podziału EV. Następnie zostaną wygenerowane zarówno próbki podzielone na części, jak i podzielone na EV (łącznie 60 próbek), które zostaną poddane triage do dwóch głównych testów, SMM dla mutacji somatycznych i proteomiki strzelby, poniżej, zarówno w celu wykazania wykonalności, jak i pilotażowej oceny surogacji kaszel do płuc.

Cel 2: Kaszel zostanie poddany analizom mutacji DNA przy użyciu SMM. Bezpośrednia analiza integralności sekwencji genomu w normalnych komórkach. Kluczowym problemem w badaniu integralności sekwencji genomu w normalnych tkankach ludzkich jest losowy charakter mutacji DNA w genomie. Podczas gdy niektóre mutacje są amplifikowane klonalnie, zdecydowana większość jest unikalna dla każdej komórki, a zatem rzadka i zmienna, co wymaga albo amplifikacji całego genomu pojedynczej komórki, albo testów amplifikacji klonalnej in vitro. Oba podejścia zostały powiązane z artefaktami. Niedawno laboratorium Maslov/Vijg opracowało niezawodne metody ilościowej oceny mutacji somatycznych w pojedynczych komórkach lub w klonalnie zamplifikowanych pojedynczych komórkach. Za pomocą tych metod wykazano, że mutacje związane z podstawieniem zasad zwiększają się wraz z paleniem (i wiekiem) w proksymalnych komórkach podstawnych nabłonka oskrzeli. Nowsza metoda analizy ilościowej mutacji somatycznych, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), jest znacznie bardziej opłacalna i może być stosowana do małych ilości masowego DNA. Ta najnowsza metoda SMM-seq jest znacząca, ponieważ pozwala, między innymi, na praktyczny sposób dokładnego wykrywania mutacji w komórkach normalnych pod względem cytologicznym.

Podejście: 20 próbek kaszlu (10 niefrakcjonowanych, 10 frakcjonowanych) zostanie poddanych ekstrakcji DNA oraz przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu, jak opisano w protokole. Mutacje somatyczne wśród wszystkich wykrytych wariantów zachodzą przez odjęcie polimorfizmów linii zarodkowej znalezionych przez analizę regularnej biblioteki sekwencjonowania z DNA tego samego osobnika. Liczba wariantów somatycznych jest znormalizowana do liczby wywoływalnych zasad, tj. zasad o pokryciu większym niż 7X w bibliotekach SMM-seq io pokryciu większym niż 20X w zwykłych bibliotekach. Częstotliwość mutacji somatycznych zostanie wyrażona jako liczba mutacji na genom. Pozostałe 40 próbek (20 z płynu do płukania jamy ustnej i 20 z BAL) zostanie przetworzonych w ramach innych bieżących mechanizmów finansowania, biorąc pod uwagę ograniczenia budżetowe.

Cel 3: Kaszel, płyn do płukania jamy ustnej i BAL zostaną poddane analizie proteomicznej przy użyciu LC-MS w zakładzie Einsteina Core. Według wiedzy zespołu badawczego nie istnieją wcześniejsze próby proteomiki w kaszlu, być może z powodu ograniczeń technicznych materiału o niskiej liczebności. Rdzeń proteomiki (Sidoli i in.) zoptymalizuje strategię w celu zwiększenia czułości i szybkości oznaczania ilościowego białek / peptydów o niskiej liczebności. Protokół przygotowania próbki zostanie zmodyfikowany, aby zminimalizować utratę próbki i zminiaturyzować chromatografię nanocieczową połączoną z najnowocześniejszą metodą MS w celu ilościowego oznaczenia białek/peptydów w próbkach BAL, MW i EBC.

Podejście: Przygotowanie próbki do proteomiki: Próbkę kaszlu suszy się do końca, a następnie ponownie zawiesza w 5 µl 50 mM wodorowęglanu amonu (pH = 8) do kanonicznego przygotowania próbki do proteomiki (20 ng trypsyny). Cała próbka jest następnie analizowana przy użyciu chromatografu nanocieczowego Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) połączonego online ze spektrometrem masowym Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Do separacji laboratorium użyje własnej kolumny analitycznej z wypełnieniem o minimalnej średnicy wewnętrznej (50 µm ID, 25 cm długości), aby można było rozdzielić cząsteczki o natężeniu przepływu ~100 nL/min. Niskie natężenie przepływu zapewnia zwiększone wstępne zatężanie próbki eluowanej z kolumny, co prowadzi do subatomolowej czułości.

Analiza danych, w tym transformacja danych, jest następnie wykonywana przy użyciu potoku w laboratorium Sidoli. W skrócie, widma MS proteomiki są identyfikowane i oznaczane ilościowo przy użyciu Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) z progami bardziej rygorystycznymi niż obecnie zalecane przez społeczność dla wskaźnika fałszywych odkryć (<1% FDR dla dopasowań widma, peptydów i białek). Wartości ilościowe są następnie przekształcane i normalizowane zgodnie z opisem laboratorium Sidoli. Regulacja statystyczna jest oceniana za pomocą statystyki parametrycznej (p< 0,05). Chromatogramy są sprawdzane ręcznie, biorąc pod uwagę stosunkowo krótką listę kandydatów.

Wszystkie próbki kaszlu (10 niefrakcjonowanych, 10 frakcjonowanych x 3 typy próbek = 60 próbek) zostaną poddane analizie proteomicznej zgodnie z opisem.

Porównania międzyprzedziałowe: Określenie surogacji kaszlu dla płuca można przeprowadzić w sposób analogiczny do tego, który wykonano dla surogacji EBC dla płuca. W obrębie danej platformy zostaną porównane poziomy (i sygnatura) mutacji SMM. W niedawnej przeszłości w wydychanym środowisku mikroRNA (nie zaproponowano tutaj), zostało to przeprowadzone przez korelacje Spearmana grupowania danych seq-microRNA w głównych składnikach, PCA (nie pokazano) i korelacje Spearmana (nie pokazano). W przypadku środowiska proteomiki to zastępstwo kaszlu dla płuc można wykazać podobnie dla kaszlu poprzez grupowanie map cieplnych, PCA i metod, takich jak korelacja Spearmana.

Wynik: To wstępne badanie pilotażowe kaszlu jako nowego biopróbki platformy jest pragmatyczną pracą translacyjną wysokiego ryzyka i wysokiej nagrody. Jeśli ten projekt pilotażowy wykaże, że kaszel jest ważnym substytutem płuc, na dwóch zbadanych platformach, dostarczy to mocnych wstępnych dowodów na wsparcie dalszego finansowania federalnego. Ten potencjał portalu opartego na drogach oddechowych do płuc można sobie wyobrazić w szerokim zakresie ostrych i przewlekłych celów klinicznych i zdrowia publicznego.