Hostefangst som en portal inn i lungen (CC1)

Hypotese: Hoste kan tjene som et gyldig ikke-invasivt surrogat for lungene for store molekyler som DNA og proteiner, potensielt for en rekke kliniske og folkehelseformål.

Forslag i korthet: For utvikling av en epidemiologisk og klinisk anvendelig plattform for store molekyler fanget unikt fra dype lunger, vil etterforskerteamet forfølge en ny tilnærming som inkluderer hosteinnsamling og testing av effektiviteten og praktiske egenskaper ved å dele hosteprøver for dype lunger. spesifikke ekstracellulære vesikler (EV). Denne hosteprøven vil bli sammenlignet med den fra invasivt innsamlede dype lungeprøver BAL/bronkialbørsting, og med potensielt kontaminerende munnskyllevann, alt fra de samme individene. Studieteamet foreslår først å undersøke disse rå hosteprøvene, og deretter EV-partisjonerte luftveisprøver, for somatiske mutasjoner ved SMM-bulksekvensering for somatiske mutasjoner, avanserte teknikker utviklet i Vijg/Maslov-laboratoriene og for proteiner som er kjent for å være spesifikke for lunge, i motsetning til munnhule/spytt, i Sidoli/proteomikk-kjernen.

Spesifikke mål:

1. Hoste vil bli fanget opp av aerochamber eller tilsvarende/optimalisert enhet hos 5 friske frivillige, og hos 5 pågående røykere, parallelt med munnskylling og med BAL. Lungespesifikke elbiler fra de samme prøvene via dyp lungefangst (Loudig lab) vil bli utført parallelt.
2. Hoste vil gjennomgå DNA-mutasjonsanalyser ved bruk av enkeltmolekylmutasjonssekvensering (SMM-seq).
3. Hoste, munnvann og BAL vil gjennomgå proteomisk analyse ved bruk av LC-MS i vårt Core-anlegg.

Nærme seg:

Praksis for Human Lung Studies-protokoll generelt: Pågående emneregistrering er en del av en langvarig IRB-godkjent Einstein-Montefiore-protokoll for klinisk case-control (2007-407). Personer fra lungepraksis som er kvalifisert til å melde seg inn er: Alder > 21 år, enhver røykestatus, utallige komorbide statuser unntatt kontraindikasjoner mot BAL, planlagt for klinisk indisert lungeinnsamlingsprosedyre (bronkoskopi) som en del av rutinemessig behandling. Dette utgjør >100-150 rekrutter til bronkoskopi og relaterte tidligere røykedonorer per år. Over 150-200 slike forhåndseksisterende bronkoskopiske prøvesett, og tilhørende ikke-invasiv EBC, sammen med MW, bukkal børste, andre] er samlet og potensielt tilgjengelig for den nåværende studien. Alle data/prøver er samlet inn før diagnose og før prosedyre; hvert individ gir EBC (og andre ikke-invasive som hoste) prøver før bronkoskopi. Som sådan minimerer denne aktive protokollen (i) tilbakekallingsskjevhet; og (ii) kontaminering av ikke-invasive prøver fra forstyrrelser og søl av lungevevet som er iboende til disse lungeprosedyrene. Hvert forsøksperson vil bli fulgt i 3 måneder i journalen for å samle oppdatert diagnostikk/testing, og minimere feilklassifisering av kasuskontroll. Omfattende demografiske, eksponerings- og kliniske data er tilgjengelige: (1) demografisk informasjon; (2) røykedetaljer: (3) markører for underliggende lungesykdom: (4) eksisterende bildediagnostikk (5) klinisk informasjon/patologiske funn. For denne ICTR-piloten:

1. Mål 1: Hoste vil bli fanget hos 5 friske frivillige, og hos 5 nåværende røykere før de gjennomgår bronkoskopi. Forsknings-BAL og munnskylleprøver vil også bli samlet inn. Lungespesifikke elbiler fra disse prøvene via dyp lungefangst (Loudig lab) vil bli utført parallelt.

Hoste vil bli fanget opp i aerochamber (vanlig, engangshåndholdt avstandsenhet for astmamåler doseinhalatorer/pumper). Etterforskerteamet har funnet ut at det er en adekvat hoste (tvungen utånding) fangeanordning, i påvente av ytterligere optimalisering. I henhold til en planlagt endring instrueres pasienten om å hoste hvert 30. sekund inn i det håndholdte plastkammeret, i løpet av en total periode på 10 minutter. Alle innvendige overflater av hele kammeret skylles deretter med 2-4 ml PBS, og skyllingen/vasken hurtigfryses. Skyllingen behandles deretter i henhold til analytten som skal studeres. For DNA er det et isopropanol/EtOH-utfellingstrinn, etterfulgt av resuspensjon i mindre volum, og ekstraksjon med Qiagen/Zymo DNA-isolasjonssett. For protein håndteres råekstraktet i PBS direkte i kjernen ved utfelling, tørking, resuspensjon i buffer og injeksjon i LC-MS-plattformen for hagleanalyser.

Prosedyren for EV-partisjonering er publisert. EV-CATCHER™ kan tilpasses for å målrette unike overflatemembranproteiner spesielt for den ønskede celletypen og dermed direkte fangst av cellespesifikke EV-er. Loudig-laboratoriet har samlet omfattende data som for eksempel viser at bruk av antistoffer rettet mot dype lungeceller unike og spesifikke proteiner (f.eks. Clara Cell Specific protein (CCSP), Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C (SFTPC)) kan spesifikt rense elbiler fra bronkoalveolære lavages (BAL) og utåndede pustekondensater (EBC) og oppnå lignende miRNA-ekspresjonsprofiler. Til slutt, ved å legge til en enzymatisk nedbrytbar uracylert dobbelttrådet biotinmerket DNA-linker mellom immobiliserende plattform (polystyren 96-brønns plate) og det aktiverte antistoffet, kan den intakte frigjøringen av immunoprensede elbiler ved inkubasjon med uracilglykosylase (UNG) forenkles.

Tilnærming: Alikvoter fra de 10 første donorene som ga hoste-, munnskylle- og BAL-prøver (5 nåværende røykere, 5 røykere som aldri røyker) på totalt 30 første prøver blant alle prøvetyper for EV-partisjonering. Deretter vil både hel-upartisjonerte og EV-partisjonerte prøver bli generert (totalt 60 prøver) som skal triageres til de to hovedanalysene, SMM for somatisk mutasjon, og hagleproteomikk, nedenfor, både for demonstrasjon av gjennomførbarhet og pilotevaluering av surrogati av hoste for lunge.

Mål 2: Hoste vil gjennomgå DNA-mutasjonsanalyser ved bruk av SMM. Direkte analyse av genomsekvensintegritet i normale celler. Et sentralt problem i å studere genomsekvensintegritet i normalt menneskelig vev er den tilfeldige naturen til DNA-mutasjoner i genomet. Mens noen mutasjoner er klonalt amplifisert, er de aller fleste unike for hver celle, og derfor sjeldne og varianter, noe som nødvendiggjør enten encellet helgenomamplifikasjon eller in vitro klonale amplifikasjonsanalyser. Begge tilnærmingene har vært assosiert med artefakter. Nylig utviklet Maslov/Vijg-laboratoriet pålitelige metoder for å kvantitativt vurdere somatiske mutasjoner i enkeltceller eller i klonalt amplifiserte enkeltceller. Ved å bruke disse metodene ble det demonstrert at basesubstitusjonsmutasjoner øker med røyking (og alder) i proksimale bronkiale epitelbasalceller. En nyere metode for kvantitativ analyse av somatiske mutasjoner, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), er mye mer kostnadseffektiv og kan brukes på små mengder bulk-DNA. Denne siste SMM-seq-metoden er viktig fordi den blant annet tillater et praktisk middel for nøyaktig å oppdage mutasjoner i cytologisk normale celler.

Tilnærming: De 20 hosteprøvene (10 ufraksjonerte, 10 fraksjonerte) vil gjennomgå DNA-ekstraksjon, og bibliotekforberedelse og sekvensering som beskrevet i protokollen. Somatiske mutasjoner blant alle de påviste variantene skjer ved subtraksjon av kimlinjepolymorfismer funnet ved analyse av vanlig sekvenseringsbibliotek fra DNA fra samme individ. Antall somatiske varianter er normalisert til antall anropbare baser, dvs. baser med dekning mer enn 7X i SMM-seq-biblioteker og med dekning mer enn 20X i vanlige biblioteker. Somatisk mutasjonsfrekvens vil uttrykkes som et antall mutasjoner per genom. De resterende 40 prøvene (20 fra munnvann og 20 fra BAL) vil bli behandlet under andre pågående finansieringsmekanismer, gitt budsjettmessige begrensninger.

Mål 3: Hoste, munnvann og BAL vil gjennomgå proteomisk analyse ved bruk av LC-MS i Einsteins Core-anlegg. Tidligere proteomikkforsøk ved hoste eksisterer ikke så vidt etterforskerteamet kjenner til, kanskje på grunn av tekniske begrensninger av materiale med lav overflod. Proteomikk-kjernen (Sidoli, et al) vil optimalisere en strategi for å øke følsomheten og hastigheten for å kvantifisere proteiner/peptider med lav overflod. Prøveforberedelsesprotokollen vil bli modifisert for å minimere prøvetapet og miniatyrisere nano-væskekromatografi kombinert med toppmoderne MS for å kvantifisere proteiner/peptider i BAL-, MW- og EBC-prøver.

Tilnærming: Prøveklargjøring for proteomikk: Hosteprøven tørkes ferdig og resuspenderes deretter i 5 µL 50 mM ammoniumbikarbonat (pH = 8) for klargjøring av kanonisk proteomikkprøve (20 ng trypsin). Hele prøven analyseres deretter ved hjelp av en Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) nano-væskekromatograf koblet online med et Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) massespektrometer. For separasjon vil laboratoriet bruke en intern pakket analytisk kolonne med minimal indre diameter (50 µm ID, 25 cm lengde) slik at molekyler med ~100 nL/min strømningshastighet kan separeres. Den lave strømningshastigheten gir forbedret forhåndskonsentrasjon av prøven som elueres fra kolonnen, noe som fører til sub-atomolfølsomhet.

Dataanalyse, inkludert datatransformasjon, utføres deretter ved hjelp av en rørledning i Sidoli-laben. Kort fortalt identifiseres og kvantifiseres proteomics MS-spektre ved hjelp av Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) med terskler som er strengere enn for øyeblikket anbefalt av fellesskapet for falsk oppdagelsesrate (<1 % FDR for spektertreff, peptider og proteiner). Kvantitative verdier blir deretter transformert og normalisert som beskrevet av Sidoli-laboratoriet. Statistisk regulering vurderes ved hjelp av parametrisk statistikk (p< 0,05). Kromatogrammer inspiseres manuelt, gitt den relativt korte listen over kandidater.

Alle hosteprøver (10 ufraksjonerte, 10 fraksjonerte x 3 prøvetyper=60 prøver) vil gjennomgå proteomisk analyse som beskrevet.

Sammenligninger på tvers av rom: Bestemmelse av hoste-surrogati for lunge kan utføres på en analog måte som for EBC-surrogati for lunge. Innenfor en gitt plattform vil nivåene (og signaturen) av SMM-mutasjon bli sammenlignet. I den siste tiden i det utåndede mikroRNA-miljøet (ikke foreslått her), har dette blitt utført av Spearman-korrelasjoner av mikroRNA-seq-dataklynging i hovedkomponenter, PCA (ikke vist) og Spearman-korrelasjoner (ikke vist). For proteomikkmiljøet kan dette surrogati av hoste for lunge vises for hoste på samme måte ved å gruppere varmekart, PCA og metoder som Spearman-korrelasjon.

Resultat: Denne første pilottestingen av hoste som en ny plattformbioprøve er pragmatisk translasjonsarbeid med høy risiko og høy belønning. Hvis dette pilotprosjektet viser at hoste er et gyldig surrogat for lunge, på de to undersøkte plattformene, vil det gi sterke foreløpige bevis for å støtte ytterligere føderal finansiering. Dette potensialet for en luftveisbasert portal til lungen kan tenkes for en lang rekke akutte og kroniske kliniske og folkehelseformål.