Captura de la tos como un portal hacia el pulmón (CC1)

Hipótesis: la tos puede servir como un sustituto no invasivo válido del pulmón para moléculas grandes como el ADN y las proteínas, potencialmente para una variedad de propósitos clínicos y de salud pública.

Resumen de la propuesta: Para el desarrollo de una plataforma epidemiológica y clínicamente aplicable para moléculas grandes capturadas únicamente de pulmón profundo, el equipo de investigadores buscará un nuevo enfoque que incluye la recolección de tos y probar la eficacia y practicidad de dividir la muestra de tos para el pulmón profundo. Vesículas extracelulares específicas (EV). Este espécimen de tos se comparará con el de muestras pulmonares profundas recolectadas de forma invasiva BAL/cepillados bronquiales, y con el enjuague bucal potencialmente contaminante, todos de los mismos individuos. El equipo de estudio inicialmente propone examinar estas muestras crudas de tos y luego las muestras de las vías respiratorias divididas en EV para detectar mutaciones somáticas mediante secuenciación masiva SMM para mutaciones somáticas, técnicas de vanguardia desarrolladas en los laboratorios de Vijg/Maslov y para proteínas que se sabe que son específicas. para el pulmón, a diferencia de la cavidad oral/saliva, en el núcleo de Sidoli/proteómica.

Objetivos específicos:

1. La tos será capturada por aerocámara o dispositivo equivalente/optimizado en 5 voluntarios sanos y en 5 fumadores actuales, en paralelo con enjuague bucal y con BAL. En paralelo, se realizarán EV específicos de pulmón de estas mismas muestras mediante captura pulmonar profunda (laboratorio de Loudig).
2. La tos se someterá a análisis de mutación de ADN utilizando secuenciación de mutación de molécula única (SMM-seq).
3. La tos, el enjuague bucal y el BAL se someterán a un análisis proteómico mediante LC-MS en nuestras instalaciones principales.

Acercarse:

Prácticas de protocolo de estudios de pulmón humano, en general: la inscripción continua de sujetos es parte de un protocolo clínico de control de casos de Einstein-Montefiore aprobado por el IRB (2007-407). Las personas de prácticas pulmonares elegibles para inscribirse son: Edad > 21 años, cualquier estado de tabaquismo, innumerables estados comórbidos excepto contraindicaciones para BAL, planificado para un procedimiento de recolección de pulmón clínicamente indicado (broncoscopia) como parte de la atención de rutina. Esto equivale a > 100-150 broncoscopias y reclutas de donantes ex fumadores relacionados por año. Más de 150-200 conjuntos de muestras broncoscópicas preexistentes y EBC no invasivo concomitante, junto con MW, cepillo bucal, otros] están almacenados y potencialmente disponibles para el estudio actual. Todos los datos/muestras se recopilan antes del diagnóstico y antes del procedimiento; cada sujeto proporciona muestras de EBC (y otros no invasivos como la tos) antes de la broncoscopia. Como tal, este protocolo activo minimiza (i) el sesgo de recuerdo; y (ii) contaminación de especímenes no invasivos debido a las alteraciones y derrames del tejido pulmonar inherentes a estos procedimientos pulmonares. Cada sujeto será seguido durante 3 meses en el registro médico para recopilar diagnósticos/pruebas actualizados y minimizar la clasificación errónea de casos y controles. Se encuentran disponibles datos demográficos, de exposición y clínicos extensos: (1) información demográfica; (2) detalles sobre el tabaquismo: (3) marcadores de enfermedad pulmonar subyacente: (4) imágenes existentes (5) información clínica/hallazgos patológicos. Para este proyecto piloto del TPIR:

1. Objetivo 1: se capturará la tos en 5 voluntarios sanos y en 5 fumadores actuales antes de someterse a la broncoscopia. También se recolectarán muestras de BAL y enjuague bucal para investigación. En paralelo, se realizarán EV específicos de pulmón de estas muestras mediante captura pulmonar profunda (laboratorio de Loudig).

La tos se capturará en una aerocámara (dispositivo espaciador de mano común y desechable para inhaladores/bombas de dosis de medidor de asma). El equipo de investigadores ha descubierto que es un dispositivo de captura de tos (exhalación forzada) adecuado, a la espera de una mayor optimización. Según una modificación planificada, se indica al paciente que tosa cada 30 segundos en la cámara de plástico portátil, durante un período total de 10 minutos. A continuación, todas las superficies interiores de la cámara completa se enjuagan con 2-4 ml de PBS y el enjuague/lavado se congela instantáneamente. El enjuague se procesa posteriormente según el analito a estudiar. Para el ADN, hay un paso de precipitación con isopropanol/EtOH, seguido de resuspensión en un volumen más pequeño y extracción con el kit de aislamiento de ADN Qiagen/Zymo. Para la proteína, el extracto crudo en PBS se maneja directamente en el núcleo mediante precipitación, secado, resuspensión en tampón e inyección en la plataforma LC-MS para análisis de escopeta.

Se publica el procedimiento de partición EV. EV-CATCHER™ se puede personalizar para dirigirse a proteínas de membrana de superficie únicas particulares del tipo de célula deseado y, por lo tanto, para capturar directamente los vehículos eléctricos específicos de la célula. El laboratorio de Loudig ha recopilado una gran cantidad de datos que demuestran, por ejemplo, que el uso de anticuerpos dirigidos a proteínas únicas y específicas de las células profundas del pulmón (p. ej., la proteína específica de células Clara (CCSP), la proteína C del surfactante de células alveolares tipo 2 (SFTPC)) puede purificar específicamente los vehículos eléctricos de lavados broncoalveolares (BAL) y condensados ​​de aliento exhalado (EBC) y obtenga perfiles de expresión de miARN similares. Por último, mediante la adición de un enlazador de ADN marcado con biotina de doble cadena uracilado degradable enzimáticamente entre la plataforma de inmovilización (placa de 96 pocillos de poliestireno) y el anticuerpo activado, se puede facilitar la liberación intacta de vehículos eléctricos inmunopurificados mediante incubación con uracil glicosilasa (UNG).

Enfoque: alícuotas de los 10 donantes iniciales que proporcionaron muestras para la tos, el enjuague bucal y el LBA (5 fumadores actuales, 5 que nunca fumaron) con un total de 30 muestras iniciales entre todos los tipos de muestras para la partición de EV. Luego, se generarán muestras enteras no particionadas y particionadas con EV (un total de 60 muestras) para clasificarlas en los dos ensayos principales, SMM para mutación somática y proteómica de escopeta, a continuación, ambos para demostración de viabilidad y evaluación piloto de subrogación de tos para pulmón.

Objetivo 2: La tos se someterá a análisis de mutación de ADN utilizando SMM. Análisis directo de la integridad de la secuencia del genoma en células normales. Un problema clave en el estudio de la integridad de la secuencia del genoma en tejidos humanos normales es la naturaleza aleatoria de las mutaciones de ADN en el genoma. Si bien algunas mutaciones se amplifican clonalmente, la gran mayoría son exclusivas de cada célula y, por lo tanto, raras y variantes, lo que requiere la amplificación del genoma completo de una sola célula o ensayos de amplificación clonal in vitro. Ambos enfoques se han asociado con artefactos. Recientemente, el laboratorio de Maslov/Vijg desarrolló métodos fiables para evaluar cuantitativamente mutaciones somáticas en células individuales o en células individuales amplificadas clonalmente. Usando estos métodos se demostró que las mutaciones de sustitución de bases aumentan con el tabaquismo (y la edad) en las células basales del epitelio bronquial proximal. Un método más nuevo para el análisis cuantitativo de mutaciones somáticas, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), es mucho más rentable y se puede aplicar a pequeñas cantidades de ADN a granel. Este último método SMM-seq es significativo porque permite, entre otras consideraciones, un medio práctico para detectar con precisión mutaciones en células citológicamente normales.

Enfoque: Las 20 muestras de tos (10 no fraccionadas, 10 fraccionadas) se someterán a la extracción de ADN y la preparación y secuenciación de la biblioteca como se describe en el protocolo. Las mutaciones somáticas entre todas las variantes detectadas ocurren por sustracción de los polimorfismos de la línea germinal encontrados por el análisis de la biblioteca de secuenciación regular del ADN del mismo individuo. El número de variantes somáticas se normaliza al número de bases invocables, es decir, bases con cobertura de más de 7X en bibliotecas SMM-seq y con cobertura de más de 20X en bibliotecas regulares. La frecuencia de mutaciones somáticas se expresará como un número de mutaciones por genoma. Las 40 muestras restantes (20 de enjuague bucal y 20 de BAL) se procesarán con otros mecanismos de financiación en curso, dadas las limitaciones presupuestarias.

Objetivo 3: La tos, el enjuague bucal y el BAL se someterán a un análisis proteómico mediante LC-MS en las instalaciones de Einstein's Core. No existen intentos previos de proteómica en la tos, según el conocimiento del equipo de investigadores, quizás debido a las limitaciones técnicas de la baja abundancia de material. El núcleo de proteómica (Sidoli, et al) optimizará una estrategia para mejorar la sensibilidad y la velocidad para cuantificar proteínas/péptidos de baja abundancia. El protocolo de preparación de muestras se modificará para minimizar la pérdida de muestras y miniaturizar la cromatografía de nanolíquidos junto con MS de última generación para cuantificar proteínas/péptidos en muestras de BAL, MW y EBC.

Enfoque: preparación de muestras para proteómica: la muestra de tos se seca completamente y luego se resuspende en 5 µl de bicarbonato de amonio 50 mM (pH = 8) para la preparación de muestras de proteómica canónica (20 ng de tripsina). A continuación, se analiza toda la muestra con un cromatógrafo de nanolíquidos Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific) acoplado en línea con un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Para la separación, el laboratorio utilizará una columna analítica empaquetada interna con un diámetro interno mínimo (50 µm de DI, 25 cm de longitud) para que se puedan separar moléculas con un caudal de ~100 nL/min. El bajo caudal proporciona una preconcentración mejorada de la muestra que eluye de la columna, lo que lleva a una sensibilidad inferior a los átomos.

El análisis de datos, incluida la transformación de datos, se realiza luego mediante una canalización en el laboratorio de Sidoli. En resumen, los espectros de MS de proteómica se identifican y cuantifican utilizando Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) con umbrales más estrictos que los recomendados actualmente por la comunidad para la tasa de descubrimiento falso (<1 % FDR para coincidencias de espectro, péptidos y proteínas). A continuación, los valores cuantitativos se transforman y normalizan como describe el laboratorio de Sidoli. La regulación estadística se evalúa mediante estadística paramétrica (p< 0,05). Los cromatogramas se inspeccionan manualmente, dada la lista relativamente corta de candidatos.

Todas las muestras de tos (10 no fraccionadas, 10 fraccionadas x 3 tipos de muestras = 60 muestras) se someterán a un análisis proteómico como se describe.

Comparaciones entre compartimentos: la determinación de la subrogación de la tos para el pulmón se puede realizar de manera análoga a la realizada para la subrogación de EBC para el pulmón. Dentro de una plataforma determinada, se compararán los niveles (y la firma) de la mutación SMM. En el pasado reciente, en el entorno de microARN exhalado (no propuesto aquí), esto se ha realizado mediante correlaciones de Spearman de agrupamiento de datos de microARN-seq en componentes principales, PCA (no se muestra) y correlaciones de Spearman (no se muestra). Para el entorno de la proteómica, esta sustitución de tos por pulmón se puede mostrar para la tos de manera similar mediante la agrupación de mapas de calor, PCA y métodos como la correlación de Spearman.

Resultado: esta prueba piloto inicial de la tos como una nueva plataforma de muestras biológicas es un trabajo de traducción pragmático de alto riesgo y alta recompensa. Si este proyecto piloto muestra que la tos es un sustituto válido del pulmón, en las dos plataformas examinadas, eso proporcionará evidencia preliminar sólida para respaldar una mayor financiación federal. Este potencial para un portal al pulmón basado en las vías respiratorias podría contemplarse para una amplia variedad de fines clínicos y de salud pública agudos y crónicos.