폐로의 포털로서의 기침 포획 (CC1)

가설: 기침은 잠재적으로 다양한 임상 및 공중 보건 목적을 위해 DNA 및 단백질과 같은 큰 분자에 대한 폐의 유효한 비침습적 대용물 역할을 할 수 있습니다.

간략한 제안: 깊은 폐에서 독특하게 포획된 큰 분자에 대한 역학 및 임상 적용 가능한 플랫폼 개발을 위해 조사팀은 기침 수집을 포함하는 새로운 접근 방식을 추구하고 깊은 폐에 대한 기침 표본 분할의 효능 및 실용성을 테스트할 것입니다. 특정 세포외 소포(EV). 이 기침 표본은 침습적으로 수집된 깊은 폐 샘플 BAL/기관지 칫솔질 및 잠재적 오염 구강청결제와 모두 동일한 개인으로부터 비교됩니다. 연구 팀은 처음에 이러한 조잡한 기침 표본을 조사할 것을 제안한 다음, Vijg/Maslov 실험실에서 개발된 최신 기술인 체세포 돌연변이에 대한 SMM 벌크 시퀀싱에 의한 체세포 돌연변이와 특이적인 것으로 알려진 단백질에 대해 EV 분할 기도 샘플을 검사할 것을 제안합니다. Sidoli/proteomics 코어에서 구강/타액과 반대로 폐의 경우.

구체적인 목표:

1. 5명의 건강한 지원자 및 5명의 현재 흡연자에서 에어로챔버 또는 이에 상응하는/최적화된 장치로 구강 세정제 및 BAL과 병행하여 기침을 포착합니다. 깊은 폐 캡처(Loudig 연구소)를 통해 이러한 동일한 샘플의 폐 특정 EV가 병렬로 수행됩니다.
2. 기침은 단일 분자 돌연변이 시퀀싱(SMM-seq)을 사용하여 DNA 돌연변이 분석을 받게 됩니다.
3. 기침, 구강 세척제 및 BAL은 핵심 시설에서 LC-MS를 사용하여 단백질체 분석을 거칩니다.

접근하다:

일반적으로 인간 폐 연구 프로토콜 실행: 진행 중인 피험자 등록은 IRB에서 오랫동안 승인한 Einstein-Montefiore 임상 케이스 컨트롤 프로토콜(2007-407)의 일부입니다. 등록할 수 있는 폐 진료소의 개인은 다음과 같습니다: 연령 > 21세, 모든 흡연 상태, BAL에 대한 금기 사항을 제외하고 무수한 동반이환 상태, 일상적인 치료의 일부로 임상적으로 지시된 폐 수집 절차(기관지경 검사)를 위해 계획됨. 이것은 연간 >100-150 기관지경 검사 및 관련 이전 흡연자 기증자 모집에 해당합니다. 150-200개 이상의 이러한 기존 기관지경 샘플 세트 및 수반되는 비침습적 EBC는 MW, 협측 브러시 등과 함께 저장되어 현재 연구에 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 모든 데이터/검체는 사전 진단 및 사전 절차를 통해 수집됩니다. 각 피험자는 기관지경 검사 전에 EBC(및 기침과 같은 기타 비침습적) 샘플을 제공합니다. 따라서 이 활성 프로토콜은 (i) 리콜 편향을 최소화합니다. 및 (ii) 이러한 폐 절차에 내재된 폐 조직의 붕괴 및 누출로 인한 비침습적 표본의 오염. 업데이트된 진단/검사를 수집하고 케이스 컨트롤 오분류를 최소화하기 위해 의료 기록에서 각 피험자를 3개월 동안 추적합니다. 광범위한 인구 통계, 노출 및 임상 데이터를 사용할 수 있습니다. (1) 인구 통계 정보; (2) 흡연 세부 사항: (3) 근본적인 폐 질환의 마커: (4) 기존 이미징 (5) 임상 정보/병리학적 소견. 이 ICTR 파일럿의 경우:

1. 목표 1: 기관지경 검사를 받기 전에 건강한 지원자 5명과 현재 흡연자 5명에서 기침을 포착합니다. 연구 BAL 및 구강청결제 표본도 수집됩니다. 깊은 폐 캡처(Loudig 연구소)를 통해 이러한 샘플의 폐 특정 전기 자동차가 병렬로 수행됩니다.

기침은 에어로챔버(천식 측정기 용량 흡입기/펌프를 위한 일반적인 일회용 휴대용 스페이서 장치)에서 포착됩니다. 조사팀은 추가 최적화가 보류 중인 적절한 기침(강제 호기) 캡처 장치임을 발견했습니다. 수정 계획에 따라 환자는 전체 10분 동안 휴대용 플라스틱 챔버에 30초마다 기침을 하도록 지시받습니다. 그런 다음 전체 챔버의 모든 내부 표면을 2-4ml의 PBS로 헹구고 헹굼/세척물을 급속 동결합니다. 이어서 연구할 분석물에 따라 헹굼이 처리됩니다. DNA의 경우, 이소프로판올/EtOH 침전 단계가 있고, 이어서 더 작은 부피로 재현탁되고 Qiagen/Zymo DNA 분리 키트로 추출됩니다. 단백질의 경우, PBS의 원유 추출물은 침전, 건조, 완충액의 재현탁 및 산탄총 분석을 위한 LC-MS 플랫폼의 주입을 통해 코어에서 직접 처리됩니다.

EV 파티셔닝 절차가 게시됩니다. EV-CATCHER™는 원하는 세포 유형에 특정한 고유한 표면 막 단백질을 표적으로 하여 세포 특정 EV를 직접 캡처하도록 맞춤화할 수 있습니다. Loudig 연구소는 예를 들어 심부 폐 세포 고유의 특정 단백질(예: CCSP(Clara Cell Specific protein), SFTPC(Alveolar type 2 cell Surfactant Protein-C))을 표적으로 하는 항체를 사용하여 EV를 구체적으로 정제할 수 있음을 입증하는 광범위한 데이터를 수집했습니다. BAL(Bronchoalveolar lavages) 및 EBC(exhaled breath condensates)에서 유사한 miRNA 발현 프로필을 얻습니다. 마지막으로, 고정화 플랫폼(폴리스티렌 96웰 플레이트)과 활성화된 항체 사이에 효소 분해 가능한 우라실화된 이중 가닥 비오틴 표지 DNA 링커를 추가함으로써 우라실 글리코실라아제(UNG)와 함께 배양하여 면역정제된 EV의 온전한 방출을 촉진할 수 있습니다.

접근법: EV 분할을 위한 모든 샘플 유형 중에서 기침, 구강청결제 및 BAL 샘플(현재 흡연자 5명, 비흡연자 5명)을 제공하는 초기 기증자 10명의 분취량 총 30개. 그런 다음 전체 분할 및 EV 분할 샘플이 생성되어(총 60개 샘플) 타당성 입증 및 대리모의 파일럿 평가를 위해 아래의 두 가지 주요 분석인 체세포 돌연변이에 대한 SMM 및 샷건 프로테오믹스로 분류됩니다. 폐 기침.

목표 2: 기침은 SMM을 사용하여 DNA 돌연변이 분석을 거칩니다. 정상 세포에서 게놈 서열 무결성을 직접 분석합니다. 정상적인 인간 조직에서 게놈 서열 무결성을 연구하는 데 있어 중요한 문제는 게놈에서 DNA 돌연변이의 무작위 특성입니다. 일부 돌연변이는 클론으로 증폭되지만 대다수는 각 세포에 고유하므로 단일 세포 전체 게놈 증폭 또는 체외 클론 증폭 분석이 필요한 희귀하고 변이체입니다. 두 접근 방식 모두 아티팩트와 연관되어 있습니다. 최근 Maslov/Vijg 연구소는 단일 세포 또는 클론으로 증폭된 단일 세포에서 체세포 돌연변이를 정량적으로 평가하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이러한 방법을 사용하여 근위 기관지 상피 기저 세포에서 흡연(및 연령)에 따라 염기 치환 돌연변이가 증가한다는 것이 입증되었습니다. 체세포 돌연변이의 정량 분석을 위한 새로운 방법인 SMM-seq(Single Molecule Mutation-seq)는 훨씬 더 비용 효율적이며 소량의 대량 DNA에 적용할 수 있습니다. 이 최신 SMM-seq 방법은 무엇보다도 세포학적으로 정상인 세포에서 돌연변이를 정확하게 검출할 수 있는 실용적인 수단을 허용하기 때문에 중요합니다.

접근법: 20개의 기침 샘플(분획되지 않은 10개, 분획된 10개)은 프로토콜에 설명된 대로 DNA 추출, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 거칩니다. 검출된 모든 변이체 중 체세포 돌연변이는 동일 개체의 DNA에서 regular sequencing library를 분석하여 발견한 생식계열 다형성을 빼서 발생한다. 체세포 변이체의 수는 호출 가능한 염기의 수, 즉 SMM-seq 라이브러리에서 7X 이상의 커버리지와 일반 라이브러리에서 20X 이상의 커버리지를 갖는 염기로 정규화됩니다. 체세포 돌연변이 빈도는 게놈당 돌연변이의 수로 표현됩니다. 나머지 40개 샘플(구강청정제 20개, BAL 20개)은 예산 제약이 있는 다른 진행 중인 자금 조달 메커니즘에 따라 처리될 것입니다.

목표 3: 기침, 구강 세척제 및 BAL은 Einstein의 핵심 시설에서 LC-MS를 사용하여 단백질 분석을 수행합니다. 기침에 대한 이전의 proteomics 시도는 조사 팀의 지식에 존재하지 않으며, 아마도 낮은 풍부 물질의 기술적 한계 때문일 것입니다. 프로테오믹스 코어(Sidoli, et al)는 풍부도가 낮은 단백질/펩티드를 정량화하기 위한 감도와 속도를 향상시키는 전략을 최적화할 것입니다. 샘플 준비 프로토콜은 BAL, MW 및 EBC 표본에서 단백질/펩티드를 정량화하기 위해 최첨단 MS와 결합된 나노액체 크로마토그래피를 소형화하고 샘플 손실을 최소화하도록 수정될 것입니다.

접근법: 단백질체학을 위한 샘플 준비: 기침 표본을 완전히 건조시킨 다음 정규 단백질체학 샘플 준비(트립신 20ng)를 위해 50mM 중탄산암모늄(pH = 8) 5µL에 재현탁합니다. 그런 다음 Orbitrap Fusion Lumos(Thermo Scientific) 질량 분석기와 온라인으로 연결된 Dionex RSLC Ultimate 300(Thermo Scientific) 나노 액체 크로마토그래피를 사용하여 전체 샘플을 분석합니다. 분리를 위해 실험실에서는 내부 직경이 최소(50µm ID, 25cm 길이)인 내부 포장 분석 컬럼을 활용하여 ~100nL/min 유속의 분자를 분리할 수 있습니다. 낮은 유속은 컬럼에서 용리되는 시료의 향상된 사전 농축을 제공하여 서브 아토몰 감도로 이어집니다.

데이터 변환을 포함한 데이터 분석은 Sidoli 연구소의 파이프라인을 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해서, Proteomics MS 스펙트럼은 거짓 발견률(스펙트럼 일치, 펩타이드 및 단백질의 경우 <1% FDR)에 대해 커뮤니티에서 현재 권장하는 것보다 더 엄격한 임계값을 가진 Proteome Discoverer(v2.5, Thermo Scientific)를 사용하여 식별 및 정량화됩니다. 정량적 값은 Sidoli 연구소에서 설명한 대로 변환 및 정규화됩니다. 통계적 규제는 파라메트릭 통계를 사용하여 평가됩니다(p< 0.05). 상대적으로 후보 목록이 짧은 경우 크로마토그램을 수동으로 검사합니다.

모든 기침 샘플(분할되지 않은 10개, 분할된 10개 x 3개 표본 유형 = 60개 샘플)은 설명된 대로 단백질 분석을 수행합니다.

구획 간 비교: 폐에 대한 기침 대리모 결정은 폐에 대한 EBC 대리모에 대해 수행된 것과 유사한 방식으로 수행될 수 있습니다. 주어진 플랫폼 내에서 SMM 돌연변이의 수준(및 서명)이 비교됩니다. 최근 호기 microRNA 환경(여기에서 제안되지 않음)에서 이것은 주성분, PCA(표시되지 않음) 및 Spearman 상관관계(표시되지 않음)에서 microRNA-seq 데이터 클러스터링의 Spearman 상관관계에 의해 수행되었습니다. 프로테오믹스 환경의 경우 폐에 대한 기침의 이러한 대리성은 히트맵, PCA 및 Spearman 상관관계와 같은 방법을 클러스터링하여 기침에 대해 유사하게 표시될 수 있습니다.

결과: 새로운 플랫폼 생물 표본으로서 기침에 대한 이 초기 파일럿 테스트는 고위험, 고보상 실용적인 번역 작업입니다. 이 파일럿 프로젝트가 검사한 두 플랫폼에서 기침이 폐의 유효한 대리임을 보여주면 추가 연방 자금 지원을 위한 강력한 예비 증거를 제공할 것입니다. 기도 기반 폐 포털에 대한 이러한 가능성은 다양한 급성 및 만성 임상 및 공중 보건 목적을 위해 구상될 수 있습니다.